黑龙江省稻瘟病菌无毒基因AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t的检测与分析

【目的】检测黑龙江省稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)无毒基因AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t在不同地区、年份间流行菌株的分布情况与变异机制,了解其等位基因的致病表型,为黑龙江省抗瘟品种布局提供参考依据。【方法】利用NCBI中公布的无毒基因序列对3个无毒基因AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t的基因全长和编码序列(coding sequence,CDS)分别设计特异性引物,将2016年和2017年采自黑龙江省不同地区335个稻瘟病菌单孢分离菌株的DNA进行PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳检测分析,并挑选不同带型和不同地区代表菌株的PCR产物进行测序。测序结果与相应无毒基因序列进行碱基与氨基酸序列的比较分析,并利用水稻抗性单基因系,对不同变异类型的稻瘟病菌菌株进行致病型测定。【结果】在PCR电泳检测中AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t均出现特异性条带,说明这3个无毒基因在黑龙江省均有分布,并以不同分布频率与突变类型出现。3个无毒基因平均扩增频率分别为75.52%、87.16%和85.67%。其中AVR-Pib通过电泳检测与PCR产物测序检测出4种带型(无带、高带、中高带与低带)和5种变异类型AVR-Pib(1-1、1-2、2、3、3-1),基因型AVR-Pib-1-1、AVR-Pib-1-2、AVR-Pib-2和AVR-Pib-3-1为新发现的变异类型,其中基因型AVR-Pib-1-1和AVR-Pib-1-2均为转座子Pot2的插入,但插入位点不同;基因型AVR-Pib-2在阅读框上游存在小片段的插入;基因型AVR-Pib-3-1碱基序列与原序列比对有4处差异,即32(C/G)35(T/A)36(T/A)38(T/A),导致氨基酸翻译提前终止。对检测到的5种等位基因型进行致病型测定,分析发现除正常基因型AVR-Pib-3外,其他变异基因型无毒功能均已丧失。而AVR-Pik经PCR产物测序检测出7种等位基因型,AVR-Pik(D、A、B、C、E、F、F2),碱基序列的变化均导致氨基酸错义突变,7种等位基因型均已见报道。无毒基因AvrPiz-t通过电泳检测和PCR产物测序分析,发现2种带型(高带和正常带型)与4种基因型AvrPiz-t(A、B、C、D),其中AvrPiz-t-A为正常基因型;基因型AvrPiz-t-B在191位处有碱基A的插入,导致氨基酸翻译提前终止;基因型AvrPiz-t-C为新发现的等位基因型,其特点在于与A类型存在17(T/C)和19位处碱基C的插入,发生移码突变翻译提前终止;高带型对应的无毒基因型AvrPiz-t-D经测序验证为Pot3转座子的插入。4种基因型菌株分别接种水稻单基因系发现,AvrPiz-t-A可以被Piz-t识别表现无毒,AvrPiz-t(B、C、D)均不能被Piz-t所识别而表现为有毒性。【结论】黑龙江省稻瘟病菌无毒基因AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t分布较为广泛,且变异类型丰富,研究结果可为选育和推广携带相应抗病基因的水稻品种提供参考。

海南省田间稻瘟病菌中AvrPiz-t基因位点变异

为评估在水稻育种中被广泛利用的广谱抗稻瘟病基因Piz-t的有效性,对不同年份分离自海南省陵水黎族自治县和三亚市水稻的273株田间稻瘟病菌株中的AvrPiz-t位点变异及其与菌株致病性的相关性进行系统研究。结果表明,海南省田间菌株中无毒基因AvrPiz-t位点的变异频率为0~100.00%,陵水黎族自治县菌株中的变异频率远远高于三亚市菌株。在菌株中共鉴定到3种AvrPiz-t位点变异类型,分别为基因位点完全缺失、DNA重复元件MGR583在基因位点启动子区-10 bp上游和编码区218 bp下游插入。所有AvrPiz-t位点变异的菌株对携带Piz-t抗病基因的单基因水稻系IRBL-11均表现出强的致病性。陵水黎族自治县菌株中AvrPiz-t位点的变异频率呈逐年增加趋势,2021年94株菌株中AvrPiz-t位点的变异频率为100.00%,其中51.06%的菌株变异是MGR583在启动子区-10 bp上游插入,表明DNA重复元件MGR583在AvrPiz-t位点插入是AvrPiz-t从无毒到有毒进化的重要机制之一。

稻瘟菌无毒基因的分子检测及其指纹类型分析

针对稻瘟菌中Avr-Pita与AvrPiz-t两个无毒基因,设计特异性引物,利用PCR方法对吉林省103株稻瘟菌菌株进行分子检测,并结合AVR-Pih、AVR-CO39、PWL2和ACE1 4个无毒基因在其中85个菌株中的分布情况,绘制出基于这6个无毒基因的指纹类型。结果表明,Avr-Pita基因和AvrPiz-t基因在吉林省稻瘟菌中的分布频率分别为86.41%和62.14%;建立的指纹类型显示,85株稻瘟菌分布于9种类型中,其中类型1为主要类型,其分布频率为40.00%;根据30个已知生理小种的菌株在指纹类型中的分布情况,初步发现类型7与吉林省优势生理小种ZE1可能存在对应关系,并应用于稻瘟菌优势生理小种的特异性分子检测;其他指纹类型与中国生理小种并无明显对应关系。明确了无毒基因Avr-Pita与AvrPiz-t在吉林省稻瘟菌中的分布情况,构建了无毒基因的指纹类型,为水稻抗瘟育种和稻瘟菌优势小种的分子监测提供理论依据。