用基因诱捕法制作Ayu17-449基因敲除小鼠模型

为了探明Ayu17449基因在小鼠生长发育过程中的功能,用特殊的诱捕载体(Genetrappingvector)导入小鼠ES细胞中,5′RACE、Southernblot方法鉴定单一捕获Ayu17449基因后,由这种ES制作了Ayu17449敲除小鼠并用Northernblot方法检测该基因在突变小鼠体内的表达。结果在Ayu17449敲除小鼠体内,诱捕载体位于Ayu17449基因的翻译起始密码上游,Ayu17449基因的转录被抑制。表明Ayu17449敲除小鼠为分析Ayu17449基因的功能提供了可靠的实验材料。

小鼠新基因Ayu17-449的克隆及表达分析(英文)

在利用PU8 捕获载体从小鼠 ES 细胞中寻找有关对发育起重要作用基因时,一阳性ES克隆编号为Ayu17-449 被捕获,经过Southern blotting法证实捕获载体单一整合在Ayu17-449号ES细胞的基因组中。通过用 5′RACE 法得到所捕获基因的一小段cDNA,在EST数据库中比对,得到一5 523 bp cDNA 序列,在Celera数据库中它包含于两个相邻基因,根据这两个基因的 mRNA 设立了一系列的引物进行 RT-PCR 和测序,用这两个基因的不同片段分别作探针进行 Northern blotting 分析,确定这是一个 RNA 约 9 kb 并编码 1 920 个氨基酸的新基因(定名为 Ayu17-449 基因,其 cDNA 序列和编码蛋白序列发表在NCBI数据库,编号为DQ079067)。Northern blotting揭示Ayu17-449基因高度表达在小鼠的脑、肾脏、心脏、肺、肌肉和胃等组织。PU8 捕获载体具有X-gal报告基因,能从蛋白表达水平揭示它所捕获的基因的表达模式。X-gal染色结果显示,Ayu17-449蛋白高度表达在小鼠的脑、肾脏、心脏等组织,与Northern blotting 法的结果高度一致。X-gal染色切片结果进一步证明 Ayu17-449 蛋白主要表达在脑的神经细胞和肾脏近曲小管细胞中。Ayu17-449 基因的编码蛋白在数据库(Scansite, http://scansite.mit.edu/)做功能基团分析后,揭示其编码蛋白的N末端含有Granin基团,大量文献证实Granin基团具有参与激素的分泌的功能,显示Ayu17-449基因可能与激素的分泌有关。