贝毒新成员--Azaspiracid shellfish poison

近年来,欧洲沿海国家发生了一系列因食用紫贻贝(Mytilus edulis)而引起人员中毒的事件。采用适宜的化学提取方法从养殖贝类的组织中提取出了azaspiracid(AZA1)及其类似物,并从养殖海区采集的厚甲原多甲藻(Protoperidinium cras-sipes)细胞中提取出了AZA1、AZA2和AZA3三种成分。鉴于这类毒素(AZAs)具有独特的化学结构和特性,把由它们引起的人员中毒事件称为AZP(azaspiracid shellfish poisoning)。根据近年来国外对AZP研究的最新进展,本文对AZAs的化学结构、来源、地理分布、毒性效应、检测方法及作用机制等方面进行了综述,并对我国开展AZP研究的重点领域提出了建议。

免疫增强剂对紫贻贝的毒素蓄积、抗氧化和免疫影响

为筛选影响紫贻贝中氮杂螺环酸毒素蓄积的免疫增强剂,设置添加维生素C(维生素C钠粉333.00 mg/L)、大黄素、花生四烯酸(6.66 mg/L)和黄芪多糖(333.00 mg/L)共4个处理组,评估不同组别紫贻贝[体质量(7.14±1.05)g]抗氧化功能和非特异性免疫指标的变化。试验结果显示:各免疫增强剂对紫贻贝存活率无影响(P>0.05),暴露期间紫贻贝软组织质量先降后升,除花生四烯酸组外其他处理组与对照组无显著性差异(P>0.05)。免疫增强剂均影响内脏团中毒素蓄积而对毒素代谢无影响。各组别最高毒素蓄积量为对照组1235.33μg/kg>维生素C组1153.12μg/kg>大黄素组755.74μg/kg>花生四烯酸组568.72μg/kg>黄芪多糖组141.43μg/kg。大黄素组、花生四烯酸组、黄芪多糖组氮杂螺环酸毒素含量分别为对照组的61.2%、46.0%和11.5%。添加黄芪多糖和花生四烯酸后,紫贻贝内脏团中超氧化物歧化酶活性显著升高(P<0.05),丙二醛含量显著降低(P<0.05),同时提高了非特异性免疫标志物溶菌酶含量和酸性磷酸酶活性。试验结果表明,花生四烯酸和黄芪多糖显著提高毒素蓄积过程中紫贻贝抗氧化和非特异性免疫能力。

核酸适配体在氮杂螺环酸检测中的应用与展望

氮杂螺环酸(azaspiracids,AZAs)是贝类滤食有毒微藻后产生的一种典型的海洋毒素,严重影响到人们的食品安全和人身安全。传统分析技术在时效性与便携度方面已经无法满足贝类食品从捕捞后快速进入餐桌的市场需求,极大限制了AZAs检测的要求和贝类产品市场准入。随着核酸适配体分析技术的兴起与快速发展,为小分子毒素AZAs的检测技术提供了一种新的解决方案。本文主要从AZAs的化学结构与毒性、传统检测方法与局限性、核酸适配体原理、分析检测技术以及核酸适配体与纳米载体的结合方式等方面总结了近十年核酸适配体技术在AZAs检测方面的发展与应用,为核酸适配体检测技术在海洋毒素快速检测等方面提供新思路。

液相色谱-串联质谱法检测贝类产品中的原多甲藻酸贝类毒素

建立了一种贝类组织中原多甲藻酸(azaspiracid,AZA)贝类毒素主要成分AZA1的高效液相色谱-串联质谱检测方法。本方法采用甲醇-水(80:20,v/v)溶液对贝类组织中AZA1进行提取,并用MAX阴离子交换固相萃取(SPE)柱富集净化,使用AtlantisdC18(150mm×4.6mm,5.0μm)色谱柱分离,以含有50mmol/L甲酸和2mmol/L甲酸铵的乙腈-水溶液(80:20,v/v)为流动相进行等度洗脱,质谱采用选择反应监测(SRM)模式。AZA1在5min内获得完全分离,且在48.85～2442ng/L范围内线性良好,相关系数为0.9981。该方法检出限(S/N=3)为11.00pg/g,添加水平为36.64、73.27、146.54pg/g时的平均回收率为75.8%～82.5%(n=6),相对标准偏差小于10%。利用该方法对采自大连、青岛、广州水产品市场上的112个贝类样品进行了分析,发现采自大连和广州的部分贝类样品中含有AZA1。结果表明,该方法具有简单、快速、灵敏度高等特点,能充分满足贝类中AZA1检测的要求。

QuEChERS净化技术结合超高效液相色谱-串联质谱法筛查食用贝类中的3种原多甲藻酸贝类毒素

采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC—MS／MS）技术，建立了贻贝、牡蛎、蚌类、扇贝等食用贝类及其制品中3种天然形式的原多甲藻酸（azaspiracid-1．azaspiracid-2，azaspiracid-3）贝类毒素的检测方法。样品采用乙腈-水（85：15．v／v）混合液均质提取．应用QuEChERS技术净化，以0．2μm做孔滤膜过滤，在乙腈-水（含5mmol／L醋酸铵和0．1％甲酸）体系下进行梯度洗脱，并在ZORBAX Eclipse Plus C18柱（100mm×2．1mm，1．8μm）上实观3种贝类毒素的基线分离.该方法采用多反应监测（MRM）模式扫描，采用标准曲线外标法定量．3种原多甲藻酸在1-100μg/kg范围内线性关系良好，相关系数（r^2）均大于0．995；3种贝类毒素的定量限（S/N=10）均为1．0μg/kg;在10、20和50μg/kg3个加标水平的添加回收率在71％～108％之间，日内和日间测定的相对标准偏差≤10％（n=6）.应用该方法对国内外多个地区的贝 类产品进行了筛查测定，发现部分样品的测定结果为阳性。该方法灵敏度高，重复性好，操作简例，快捷，适用于食用贝类及其制品中3种原多甲藻酸贝类毒素的分析测定。

液相色谱-串联质谱法测定双壳类水产品中原多甲藻酸类贝类毒素

建立了双壳类水产品中原多甲藻酸贝类毒素Azaspiracid 1(AZA1)、Azaspiracid 2(AZA2)和Azaspir-acid 3(AZA3)的液相色谱-电喷雾串联质谱检测方法。选用具有基质代表性的扇贝、牡蛎和杂色蛤为研究对象,样品经80%甲醇-水混合溶液提取,正己烷脱脂、氯仿反提萃取并旋转蒸发浓缩后,MAX混合型阴离子交换反相吸附固相萃取柱净化,Luna C18色谱柱(150 mm×2.0 mm,5μm,Phenomenex公司)反相液相色谱法分离,乙腈和0.1%甲酸溶液组成的流动相梯度洗脱,正离子扫描,多反应监测(MRM)模式下电喷雾串联质谱法测定和确证,外标法定量。结果表明,3种原多甲藻酸类贝类毒素均在4 min内出峰,检出限均为1.5μg/kg,在0.3～30μg/L范围内线性良好,平均回收率大于80%,相对标准偏差(RSD)小于12%(n=6)。

超高压液相色谱-高分辨质谱快速筛查和确证食用贝类中多种原多甲藻酸贝类毒素

建立超高压液相色谱-高分辨质谱快速筛查和确证贻贝、牡蛎、蚌类、扇贝等食用贝类及其制品中3种天然形式的原多甲藻酸贝类毒素的检测方法。样品中的原多甲藻酸采用乙腈-水体系均质提取，应用改进型QuEChERS技术净化，在乙腈-水（含5mmol／L醋酸铵和0．1％甲酸）体系经AcquityHSST3柱（150mm×2．1mm，1.8μm）梯度洗脱，实现了3种原多甲藻酸贝类毒素的基线分离。该方法基于电喷雾正离子模式，采用高分辨质谱一级全扫描和数据依赖扫描，对食用贝类及其制品样品中的原多甲藻酸贝类毒素进行检测。3种贝类毒素的定量限均为10μg／kg（RSN〉10）；在10-500μg／L范围内线性关系良好，相关系数（R^2）均大于0．99。应用该方法对国内外多个地区的贝类产品进行了筛查及确证，其中部分样品检出原多甲藻酸贝类毒素。该方法灵敏度高，重复性好，操作简便、快捷，适用于食用贝类及其制品中多种原多甲藻酸贝类毒素的筛查分析。

氮杂螺环酸毒素在栉孔扇贝体内的代谢规律

氮杂螺环酸毒素(azaspiracids,AZAs)隶属八大类海洋贝类毒素,为一类含氮且具独特螺环结构的聚醚类毒素。采用液相色谱-三重四级杆复合离子阱质谱,研究了分离自中国近海的1株氮杂螺环酸产毒藻腹孔环胺藻(Azadinium poporum,AZDY06)所产氮杂螺环酸毒素在栉孔扇贝体内的蓄积、分布和生物转化机制。通过将栉孔扇贝暴露产毒藻的方式,分析扇贝内脏团、裙边、闭壳肌和其他可食组织4个组织部位的AZAs及其代谢产物分布,研究栉孔扇贝对毒素的代谢机理。结果表明,AZDY06主要产生AZA2毒素,单细胞产毒能力最高为(7.05±0.52)fg/cell;扇贝12 h内摄食5×10~7个产毒藻细胞后,体内AZAs毒素含量已超欧盟安全限量,达165.3μg AZA1eq/kg,蓄积效率为78.2%。AZAs毒素在扇贝各组织间分布存在显著差异:内脏团>其他可食组织>外套膜>闭壳肌。AZA2在扇贝中潜在转化方式为羟基化、去羧基化和氧化,共生成4种代谢产物:AZA6、AZA12、AZA19和AZA23,其中AZA19为最主要代谢产物,约占总毒素40%,其他代谢产物含量较低。本研究证明中国近海分布氮杂螺环酸产毒藻毒性危害较强,建议有关部门加快制定AZAs限量标准。

原多甲藻酸贝类毒素的研究进展

近年来,欧洲沿海地区频繁出现一种新毒素Azaspiracid(AZA)导致的中毒事件,给水产品质量安全工作带来了新的挑战。目前对这类新型毒素的毒性及致毒机理还不清楚,缺少相应的贝类毒素检测方法。为此,本文对有关AZA毒素的来源、理化性质、毒性、致毒机理、检测方法等内容进行了综述,并建议中国开展相关的研究工作,以期帮助人们认识这一新型毒素,为进一步开展相关研究提供参考依据。

液相色谱-串联质谱法筛查原多甲藻酸毒素及其代谢产物

建立了原多甲藻酸毒素(azaspiracids,AZAs)及其代谢产物的液相色谱-串联质谱检测方法,考察了目标代谢产物检测方法和非目标多离子检测方法,将二级质谱图与标准品谱库进行比对,从而获得高精准定性。通过对产毒藻、蓄积代谢实验样品和实际阳性样品综合分析,共检出11种AZAs,其中包括AZA-2,3,6,11,12,16,17,28和36,以及AZAs的谷胱甘肽结合型代谢产物。结果发现,目标代谢产物检测法可无偏差地筛出常规代谢物,而且对低浓度代谢产物表现出更佳的响应。本方法重现性好,数据分析简单,对操作人员的专业要求不高,更适合AZAs的监控要求。

石墨烯-管尖固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定贝类中3种原多甲藻酸贝类毒素

本实验以石墨烯为吸附剂,制作了石墨烯-管尖固相萃取装置,结合高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)技术,建立了一种同时测定贝类中3种原多甲藻酸贝类毒素的分析方法。样品采用90%的甲醇提取,正己烷去脂,乙酸乙酯反萃取,石墨烯-管尖固相萃取净化,Kinetex XB-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,2.6μm)分离,在电喷雾正离子模式下,以选择反应监测方式测定,外标法定量。结果表明,贝类中3种原多甲藻酸毒素在1.0~100μg/kg的范围内线性良好,相关系数均大于0.99,定量限(LOQ)均为1.0μg/kg;在1.0μg/kg、5.0μg/kg和50μg/kg 3个加标水平的添加下,回收率在78.5%~102%之间,相对标准偏差小于15%。该方法具有灵敏、简单、快速等特点,适用于贝类水产品中3种原多甲藻酸毒素的分析检测。

氮杂螺环酸毒素的生态分布、蓄积代谢与检测技术监控研究进展

中国是世界上赤潮灾害发生最严重的国家之一。近年来,与赤潮伴生的贝类毒素污染事件多发,给中国的近海生态、消费者的食用安全构成了威胁。其中氮杂螺环酸毒素(azaspiracids,AZAs)即为在中国海域最新发现的毒性强、残留高且代谢慢的一类脂溶性贝类毒素。研究发现,AZAs产毒藻广泛分布于中国近海,该毒素在双壳贝类中也多次被检出,已成为贝类质量安全的又一重要隐患。文章综述了AZAs的理化性质以及其毒性机理,现有的中国监控手段,并对生物检测法和液相色谱检测法等常用的检测方法以及全球化分布趋势进行综合性评价,以期为相关风险评估研究提供参考。

原多甲藻酸(AZA1)对Hep-G2细胞毒理作用的研究

为了研究原多甲藻酸(AZA1)的毒理作用,试验以Hep-G2细胞为作用对象,采用CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒测定吸光度值,对不同浓度原多甲藻酸的毒理作用进行测定。结果表明:当原多甲藻酸浓度达到40 nmol/L时,对细胞毒理作用显现;当浓度达到60 nmol/L时,对细胞毒理作用显著。说明双壳贝类中一定量的原多甲藻酸会对人类健康产生影响。

UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS非定向筛查贝类中氮杂螺环酸毒素及其代谢产物

为了分析复杂贝类和微藻中的氮杂螺环酸毒素(AZAs)及其代谢产物,建立一种基于超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱(UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS)联用技术的非定向筛查分析方法。采用Full MS/dd MS^2、PRM和Target-SIM/dd MS^2三种质谱鉴定模式,整合多种数据采集挖掘策略,通过研究多种AZAs在不同基质样品中的质谱裂解规律及特征碎片离子丰度,实现AZAs及其衍生物的快速筛查检测和精准鉴别。结果表明:PRM模式能有效排除AZAs同分异构体的干扰,获得更高的专属性,适用于目标代谢物筛查;应用Full MS/dd MS^2和PRM结合的方式,根据AZAs裂解途径及多种AZAs代谢产物裂解规律,在贝类中共鉴别出20种AZAs系列化合物,其中包括初步推测了3种新型AZAs代谢产物的结构。应用本方法还发现AZA9、AZA10、AZA19等代谢物均随代谢过程持续升高,是AZA2在贝类代谢过程中的末端产物。该方法能够为复杂基质中的AZAs系列毒素及其衍生常规检测与精准鉴别提供参考,可应用于解析AZAs毒素在贝类体内的代谢转化机制研究。

氮杂螺环酸贝类毒素的研究进展

氮杂螺环酸也称原多甲藻酸,是一种具有独特螺环结构的聚醚类毒素,其对水产品的食品安全和消费者健康威胁极大,因此被双壳软体生物毒素工作组列为常见贝类毒素之一。但迄今人们对有关氮杂螺环酸的致毒机理、分子靶点以及生物毒性等,尚缺乏深入的了解。为推进对该类毒素的研究,本文就氮杂螺环酸的来源、检测方法、毒性及致毒机理以及对贝类生物的影响等进行了综述,并提出了未来需重点关注和解决的问题。

栉孔扇贝对氮杂螺环酸毒素代谢解毒的生理应激响应

将栉孔扇贝(Chlamys farreri)暴露于分离自我国近海的一株氮杂螺环酸毒素(azaspiracids,AZAs)产毒藻——腹孔环胺藻(Azadinium poporum,AZDY06株,主产AZA2),研究了栉孔扇贝对AZAs的代谢解毒效应以及代谢过程中血细胞数量、抗氧化酶活性及细胞超微结构变化等生理应急响应。结果发现,栉孔扇贝对AZDY06所产的AZA2具有一定的代谢解毒能力,可将AZA2转化成AZA6、AZA12、AZA19和AZA23等4种极性较强且毒性较低的代谢产物。代谢解毒过程中,栉孔扇贝血细胞数量、关键抗氧化酶活性及靶器官细胞超微结构均出现一定的应激效应,且总体表现出明显的剂量-效应关系。栉孔扇贝血细胞数量对AZAs表现出较强的应激反应,且随实验过程出现较大波动,最高可达对照组的2—3倍;抗氧化系统酶如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化物酶(POD)和酸性磷酸酶(ACP)活性也出现不同程度的变化:GSH-Px与POD在整个蓄积代谢过程中均表现出持续激活状态,且血液中这两种酶活性最高,可达内脏和鳃中的20倍以上;SOD活性与扇贝中AZAs含量有一定关系,AZAs含量为74.2—168.2μg AZA1 eq/kg时为诱导状态,过高或过低剂量均表现为抑制效果;而ACP对AZAs的应激表现也十分敏感,但代谢过程中大部分时间为被持续抑制状态。此外,AZAs还导致栉孔扇贝内脏和鳃细胞超微结构出现空泡化、核固缩等病理性变化;实验后期,低暴露组细胞结构出现一定的自我修复现象,而高暴露组则无此现象。本研究可为进一步深入探索AZAs的解毒机制,对其进行风险评价并制定限量标准提供科学依据。

甲藻门环胺螺环藻属和环胺螺环藻酸研究进展

环胺螺环藻酸(Azaspiracid,AZA)是最近发现的一种贝类毒素,近年来在毒素成分、结构和毒性大小以及产生这类毒素的甲藻物种多样性研究上取得了快速的进展。对产毒藻的物种多样性、地理分布、形态学和系统发育以及毒素成分的研究进展进行了综述。

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定贝类水产品中原多甲藻酸类和大田软海绵酸类毒素

目的采用超高效液相色谱-串联质谱法建立贝类产品中AZA1、AZA2、AZA3、OA、DTX1、DTX2多种毒素的定性、定量检测方法。方法贝类样品用甲醇提取后,Strata-X固相萃取柱净化。采用ACQUITY UPLCTMBEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7μm)色谱柱分离,多反应监测模式(MRM)对目标化合物定性及定量分析。结果所检测的贝类毒素线性相关系数均大于0.998;方法定量下限(LOD)为0.05μg/kg^0.8μg/kg;高、中、低3个添加水平的平均加标回收率在85.6%~96.7%之间,相对标准偏差为3.6%~11.4%。结论该方法灵敏度高、操作简单高效,适用于贝类水产品中原多甲藻酸毒素和大田软海绵酸贝类毒素的同时检测分析。