猪瘟病毒E2蛋白部分抗原区基因在原核系统的分泌表达与鉴定

基于猪瘟病毒主要保护性抗原E2囊膜糖蛋白有两个相对独立的抗原结构单位B/C抗原区和A/D抗原区,根据GeneBank中猪瘟病毒B/C基因核苷酸序列设计合成一对引物,经RT-PCR扩增猪瘟病毒B/C基因。将扩增所得猪瘟病毒B/C基因克隆于PMD18-T载体,然后定向亚克隆猪瘟病毒B/C基因至原核表达载体PET30(a)的多克隆位点中,经酶切鉴定后,将含有B/C基因的重组质粒命名为PETB/C。用PETB/C转化受体菌BL21,挑取单个菌落,用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导,并在不同诱导时间收集样品。经SDS-PAGE电泳分析证实B/C基因获得了表达,并在终浓度为1mM的IPTG,诱导6h其表达达到高峰,经Western-blot分析证实表达的重组B/C蛋白具有反应活性,大小约为9KD。用表达产物作ELISA,结果表明表达产物与猪瘟病毒抗血清可发生明显的反应,而与其它8种疫病阳性血清不发生反应。正常菌体蛋白与猪瘟病毒阳性血清也不发生反应。通过对58份送检血清样品的检测结果显示其与Dot-ELISA的相符率高达95%以上。试验证明利用原核表达系统制备的重组蛋白作为诊断用抗原,为研究亚单位疫苗或诊断抗原打下坚实基础。

猪传染性胃肠炎病毒截短S基因原核表达及免疫原性初步检测

为监测猪场猪群中猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)抗体水平,本研究利用TGEV冻存液,通过RT-PCR扩增得到S基因的主要抗原片段B/C区约560bp,将其酶切后连接到pET-32a载体,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。挑取转化成功的部分菌落进行PCR试验,将目的条带正确的菌落添加到LB培养基过夜培养,提取重组质粒并送测序。培养测序正确的菌液,利用IPTG诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE试验,在约37ku位置有一明显的目的条带。利用自制猪传染性胃肠炎兔血清通过Western blotting试验检测纯化的重组蛋白,在37ku处可见一条带,表明此重组蛋白具有一定的免疫原性。本研究将有助于研究TGEV ELSIA检测试剂盒的组装并进行TGEV抗体水平的监测,为猪场免疫情况提供相应参考。