利用单B细胞分选技术制备猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体及其在ELISA中的应用

本研究旨在建立一种猪瘟病毒E2单抗竞争ELISA检测方法,用于评价猪瘟C株弱毒苗和E2亚单位疫苗的免疫效果。首先,构建猪瘟E2杆状病毒表达载体pFastBAC,通过悬浮培养SF9细胞高效表达E2蛋白;其次,用纯化的E2蛋白免疫BABL/c小鼠,通过流式分选IgM-PE-/E2-APC+型单个B细胞。然后,利用半巢式PCR分别扩增E2特异性IgG抗体的重链和轻链,测序后将抗体重链及轻链构建到pCDNA3.1载体,再将构建好的质粒共转染至HEK-293细胞,制备猪瘟E2单克隆抗体。结果表明,本研究通过单B细胞分选技术获得的两株单克隆抗体,即mAb3A9(IgG1,kappa)和mAb4F7(IgG2a,lambda),分别识别猪瘟E2蛋白B细胞线性表位25GLTTTWKEYSHDLQL^(39)和259GNTTVKVHASDERGP^(273)。此外,用上述两株单克隆抗体及E2蛋白建立的单抗竞争ELISA检测方法,在血清样本检测过程中,均展现出优异的诊断敏感性(97.49%,95.97%)及特异性(96.08%,94.38%),该研究为我国猪瘟的逐步净化提供了有利的技术支撑。

乙型肝炎病毒(HBV)的ELISA检测及化学发光法检测的诊断价值

目的 本研究探讨化学发光法与酶联免疫吸附法在(HBV)中的诊断价值。方法 收集本院2020年6月—2023年4月收治的300例乙型病毒性肝炎病例的血标本为观察组,另随机选择同期住院的300例非乙型病毒性肝炎病例的血标本为对照组。两组均采用HBV的ELISA检测及化学发光法检测,对比两组检测结果。结果化学发光法对HBV的标准曲线相关系数R2=0.998,平均批内变异系数2.98%,批间变异系数4.20%,优于ELISA检测的平均批内变异系数6.27%及平均批间变异系数7.74%;化学发光法的最低检出浓度为2.5ng/mL,ELISA检测乙型肝炎病毒最低检出浓度为25ng/mL,化学发光法灵敏度优于ELISA检测法。ELISA检测阳性率明显低于化学发光法检测结果,阴性率高于化学发光法。结论 化学发光法有利于早期诊断乙型病毒性肝炎,较ELISA检测具有很高的灵敏度与特异度。

黄曲霉毒素B_1直接竞争抑制ELISA快速筛选法的建立

采用辣根过氧化物酶标记高亲和力的黄曲霉毒素Ｂ１抗体，建立了标记抗体型直接竞争抑制ＥＬＩＳＡ快速筛选法。该法检测ＡＦＢ１的线性范围为０．２５～５．０ｎｇ／ｍＬ，灵敏度为１２．５ｐｇ。

ELISA法快速检测黄曲霉毒素B_1

利用ＥＬＩＳＡ法的ＡＦＢ１试剂盒测定了食品、饲料等样品中的ＡＦＢ１含量。本方法重复性好，ＲＳＤ＝７．８％，灵敏度为２．５ｐｇ，平均回收率为８９％～９５％，其结果与ＴＬＣ法比较有较好的相关性，且灵敏度高于ＴＬＣ法１６０倍。本法具有快速、简便和一次可批量定性定量的优点，适用于食品。

猴B病毒BVgD-多肽ELISA检测方法的建立

目的建立猴B病毒抗体BVgD-多肽ELISA检测方法。方法以Western-blot分析猴B病毒糖蛋白D(BVgD)上的多肽抗原决定簇(BVgD-多肽)的抗原性,采用方阵滴定法,确定ELISA法的最佳实验条件。用灭活BV全病毒、HSV-1和BVgD-多肽三种抗原系统对猴血清样品进行平行检测,比较分析了三种系统的抗原性特点。并且将检测结果与美国BV抗体检测试剂盒的检测结果进行了比较。结果建立了猴B病毒抗体的BVgD-多肽ELISA法,研究结果表明本方法与BV全病毒和以HSV-1病毒为抗原的试剂盒相比,敏感性较低、特异性较好,避免了制备BV抗原对实验室要求高和HSV-1抗原引起的非特异性问题。检测结果与美国实验室BV抗体检测结果的符合率达85%。

黄曲霉毒素B_1间接竞争抑制ELISA定量分析法的建立和应用

以合成的黄曲霉毒素Ｂ１（ＡＦＢ１）－Ｃ３－羧甲基肟－牛血清白蛋白为免疫原，制备了高亲和力的多抗血清，建立了简便、灵敏的ＡＦＢ１间接竞争抑制ＥＬＩＳＡ定量分析法。ＡＦ类似物Ｂ１，Ｂ２，Ｇ１和Ｇ２与ＡＦＢ１抗体的相对交叉反应率分别为１００％，３．４％，９．１％和小于１．３％。本法测定ＡＦＢ１的线性检测范围为１２．５～２５０ｐｇ，批内和批间平均变异系数分别为５．３％和７．９％，大米和混合饲料中测定ＡＦＢ１的回收率分别为７９．０％和８１．８％。用本法对６８份样品进行了分析，ＡＦＢ１自然污染率为１１．８％，其中采自江苏某地的玉米样品污染ＡＦＢ１最高达６８２．７μｇ／ｋｇ。本法适用于大批量样品的快速检测。

小反刍兽疫病毒N蛋白B细胞表位预测、合成及间接ELISA方法的建立

基于氨基酸序列和采用Gamier-Robson和Chou-Fasman等多种方法分析的α-螺旋、β-折叠和转角等二级结构结果,预测小反刍兽疫病毒N蛋白的B细胞抗原表位。设计4段多肽并进行人工合成,作为包被抗原建立小反刍兽疫血清抗体间接ELISA检测方法,用于检测小反刍兽疫山羊临床血清样品,以对预测的B细胞抗原表位进行验证。结果显示,研制的间接ELISA敏感性为96.0%,特异性为96.25%,与进口标准竞争ELISA试剂盒的符合率为96.15%。结果表明,研制的间接ELISA方法适用于小反刍兽疫临床血清抗体的检测。

牛传染性鼻气管炎病gB蛋白的截短表达及间接ELISA方法的建立

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）的间接ELISA方法,本研究根据Gen Bank登录的IBRV全基因组序列,设计引物扩增糖蛋白B（g B）基因编码第190～524氨基酸残基（aa）的基因,构建重组质粒p ET-g B进行原核表达。SDS-PAGE结果显示目的蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达,大小约为40 ku。Western blot鉴定表明目的蛋白具有良好的反应原性。以纯化的g B蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA检测方法,该方法敏感性好,特异性强,与其他病原血清无交叉反应,其组内组间变异系数均低于11%。与IDEXX公司的g B-ELISA试剂盒进行对比,阳性符合率为84.28%,阴性符合率为85.71%。采用本研究建立的方法对黑龙江省10个农场的血清样品进行了IBR的流行性调查,阳性率最高为65.52%,最低为5.56%,平均阳性率为18.01%。本研究建立的ELISA方法为进出口检疫和该病防制工作提供一种可选方法。

应用ELISA方法快速检测IHNV—B病毒

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)快速诊断病毒性疾病,由于具有灵敏度高、特异性强和简便等优点,已在医学和兽医学上得到了广泛的应用。在鱼类病毒检测方面,Dixon,P.F.和Hill,B.J.用ELI-SA方法(1983)快速检测传染性胰脏坏死症病毒(IPNV)和(1984)几种鱼类弹状病毒,江育林等(1990)曾报道用此技术快速检测IPN病毒,1990年在我国本溪虹鳟鱼苗中分离出一株弹状病毒,暂称之为传染性造血器官坏死症病毒中国本溪株(IHNV-B),由于该病毒对虹鳟(rainbow trout)鱼苗危害极为严重,为预防和控制其蔓延,本文报道了应用ELISA方法对感染的鱼苗、鱼卵和细胞培养物中的IHNV-B病毒进行快速检测,可用目测或酶标检测仪来判定结果。

多粘菌素B预包被ELISA反应板检测抗内毒素抗体

由于细菌脂多糖（ＬＰＳ）水溶性差，用传统的ＥＬＩＳＡ检测抗－ＬＰＳ抗体抗原用量大，敏感性不理想。我们用能和ＬＰＳ结合的多粘菌素Ｂ（ＰＭＢ）预先包被微量反应板，可使随后加入的ＬＰＳ（光滑型和粗糙型）包被效率增加，检测抗－ＬＰＳ抗体（单克隆抗体和动物免疫血清）的敏感性显著增加（最高达１２８倍）。

双抗体夹心ELISA检测SEB方法的建立及在不同基质中检测的应用

目的:建立检测SEB的双单克隆抗体(mAb)夹心ELISA,并检测在多种基质中SEB的敏感性。方法:制备、纯化抗SEBmAbB4和D6。D6mAb标记辣根过氧化物酶(HRP)作为检测抗体,B4mAb作为包被抗体。结果:成功建立了敏感、特异检测SEB的ELISA方法,检测抗体稀释液和小牛血清中SEB,检测灵感度0.2μg/L,定量线性范围0.78～12.5μg/L,r2=0.992,批间变异系数(CV)<10%,回收率80%～110%。检测50g/L脱脂牛奶、尿液和自来水中的SEB,灵敏度0.39μg/L,定量线性范围0.78～25μg/L,r2=0.997。与SEA和SECl无交叉反应。结论:本方法测量准确,灵敏度高,特异性好,在食品工业和临床标本检测中有广阔的应用前景。

探讨ELISA方法中HBsAg弱阳性标本复查方式及其意义

目的探讨酶联免疫吸附试验(ELISA)方法中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)弱阳性标本复查方式,确保结果的准确可靠。方法用ELISA法筛查出144例如下的标本:①S/CO值0.8～0.99,14例;②S/CO值在1.0～1.99,60例;③S/CO值在2.0～4.99,38例;④S/CO值在5.0～15,32例,以上标本均进行Elecsys HBsAg定量试验和HBsAg确证试验,对结果进一步确证。结果 144例标本中,三种方法都阳性的标本有62例,Elecsys HBsAg定量试验阳性62例,HBsAg确证试验阳性64例,ELISA与Elecsys HBsAg定量试验,ELISA与HBsAg确证试验比较,均有显著性差异(P<0.05),Elecsys HBsAg定量试验与HBsAg确证试验比较,结果没有显著性差异(P>0.05)。结论 ELISA试验做为临床乙肝的筛查方法容易出现假阳性,弱阳性标本可以用Elecsys HBsAg定量试验进行快速复查。

猴B病毒抗体ELISA检测试剂盒的制备及准确性评价

目的:以金标准试剂盒为参照,对新研制的猴B病毒抗体ELISA检测试剂盒进行准确性评价,以期为我国实验灵长类动物产业提供优质廉价的检测试剂。方法:利用3个批次共表达猴B病毒gD和g B蛋白的细胞上清分别制备ELISA检测试剂盒,与金标准试剂盒(VRL的ELISA试剂盒)同时对667只食蟹猴血清进行检测,考察新研制剂盒的准确性;然后,挑选强阳性、弱阳性、阴性样品,用另外2个批次ELISA试剂盒检测,考察不同批次试剂盒检测结果的稳定性。结果:金标准试剂盒对667只食蟹猴血清抗体检测结果为阳性280份、阴性387份,而新研制的ELISA试剂盒结果为阳性282份、阴性385份;与金标准相比,阳性样品的符合率为98.93%(277/280),阴性样品的符合率为98.97%(383/387),总体符合率为98.95%(660/667)。对100份强阳性样品、70份弱阳性样品、108份阴性样品及7份差异样品的重复检测表明,除1份弱阳性(金标准为阴性)检测为阴性外,其余样品与前期一致。结论:与金标准相比,新研制的试剂盒具有较高的准确性,可用于猴B病毒抗体的检测。

鸭瘟病毒gB蛋白N端主要抗原域的表达及间接ELISA检测

在分析鸭瘟病毒gB蛋白抗原性的基础上,设计一对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因。将克隆的基因定向插入pET-32a的EcoRⅠ和HindⅢ之间,构建了gB蛋白主要抗原域原核表达载体pET-gB1。将pET-gB1质粒转化BL(21)宿主菌后,对培养和表达条件进行了优化,实现了DPVgB蛋白主要抗原域的高效表达。免疫印迹试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性。应用His·Bind亲和层析柱纯化重组DPVgB蛋白,以纯化的重组gB1蛋白作为检测抗原,初步建立了检测鸭瘟病毒抗体的igB1-ELISA。结果表明,抗原的最佳包被浓度为6.5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:待检血清OD490>0.4,且待检血清OD490/阴性血清OD490>2。应用igB1-ELISA对鸭血清样品进行检测,结果表明igB1-ELISA与全病毒包被的iDPV-ELISA符合率达到95.6%。

荧光定量PCR检测HBV-DNA与ELISA法乙肝免疫学检测的探讨

目的探讨荧光定量PCR法检测HBV-DNA与ELISA法乙肝免疫学指标的相关性。方法采用ELISA法和荧光定量PCR技术分别对353例乙型肝炎患者血清进行免疫学指标的检测及HBV-DNA的定量检测。结果 ELISA法呈大三阳组患者的HBV-DNA阳性率及病毒平均拷贝数均高于小三阳组;HBeAg(+)组的阳性率及病毒平均拷贝数高于HBeAg(-)组;HBeAb(+)组有较低的HBV-DNA阳性率及病毒平均拷贝数。结论 HBV-DNA的含量与乙肝免疫学检测结果具有相关性。临床上应注意两者联合应用。

ELISA方法测定血清中Hib多糖抗体含量的条件比较研究

分别以牛血清白蛋白和人血清白蛋白作为封闭液的主要成分测定7份血清中抗b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的抗体含量,结果显示,两组数据之间没有显著性差异(P>0.05)。分别用HRP标记的羊抗人IgG和HRP标记的鼠抗人IgG测定该7份血清,结果显示两组结果无显著性差异(P>0.05)。同时,将血清反应的温度和时间由37℃1.5h改为4℃16h(过夜),结果显示两者无显著性差异(P>0.05)。从而优化了该方法。

单克隆抗体ELISA法对肝癌患者HBV基因分型的初步探讨

目的 初步探讨单克隆抗体法对肝癌患者血清中HBV基因分型的意义。方法 用反向被动血凝法(ReversedPassiveHemagglutination ,RPHA)筛选肝癌患者血清中的乙型肝炎病毒 (HBV)的表面抗原 (HBsAg) ,再以日本学者最近新开发的单克隆抗体ELISA法 (mAbsELISA)对HBV进行基因分型。结果 2 2例肝癌患者中有 14例( 63 6% )HBsAg阳性 ,基因分型均为C型 ( 10 0 % ) ,没有发现其它基因型。结论 C基因型是HBV相关肝癌的主要病毒基因型。mAbsELISA法操作简单 ,适于大规模研究。

应用捕捉法ELISA检测乙肝患者血清中IgG类HBsAg特异性免疫复合物

本文建立了一种检测HBsAg/IgC—CIC(Circulating ImmuneComplex)捕捉法ELISA(Enzyme Linked Immunosorbert Assays)。该法特异性强,敏感性高,重复性好,避免了固相抗HBs双抗体ELISA受血清中游离HBsAg的抑制作用而影响HBsAg/IgG—CIC检出的缺点。并行检测HBsAg/IgG—CIC和血清C_3发现,乙肝患者血清中HBsAg/IgG—CIC检出率血清C_3下降显著高于非下降组,提示HBsAg/IgG—CIC可能是导致乙肝患者血清C_3下降的又一重要因素。

电化学发光法和ELISA法检测HBV表面抗体结果的比较与分析

目的分析电化学发光法和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBV表面抗体(HBsAb)的结果差异。方法经罗氏E601全自动免疫分析仪检测,HBsAg与HBsAb同时阳性的样本65例,另有HBsAg阴性HBsAb阳性的健康体检者血清样本63例,应用甲、乙两种ELISA试剂重新检测其HBsAb。结果当HBsAg阳性时,甲、乙ELISA试剂检测HBsAb存在明显的漏检,其相对漏检率分别为84.62%与78.46%。将血清样本稀释后重新检测,上述漏检情况无明显改善。当HBsAg阴性时,甲、乙ELISA试剂检测HBsAb的相对漏检率分别为4.76%与7.94%。结论 ELISA法检测血清HBsAb明显受到HBsAg的影响,改善ELISA试剂盒性能非常必要。对确诊的乙肝患者或乙肝疫苗接种前、后需检测HBsAb者,应考虑使用化学发光试剂,以减少因HBsAg带来的干扰。

以金黄色葡萄球菌重组IsdB137-361为抗原的牛血清抗体间接ELISA检测方法建立

奶牛乳房炎是危害奶牛健康和影响奶业发展的重要而常见奶牛疾病,金黄色葡萄球菌(S.aureus)是引起奶牛乳房炎的重要病原菌,已经用S.aureus铁调节的表面决定簇B(IsdB)的免疫优势片段IsdB_(137-361)与其他抗原成分构建了预防S.aureus感染的奶牛乳房炎候选疫苗(命名为GIT)。为了检测该候选疫苗免疫奶牛后的IsdB_(137-361)相关抗原的血清抗体,用pGEX-6p-1表达的IsdB_(137-361)作抗原建立了牛血清抗体间接ELISA检测方法。通过对抗原包被浓度、血清稀释倍数和反应条件进行了优化,确定cut-off值检测了血清交叉反应性和敏感性。结果显示,在抗原使用浓度为2.5μg·mL^(-1)-1、血清1:1000倍稀释、cut-off值为0.45时,该方法具有良好的特异性和敏感性。表明,所建立的间接ELISA检测方法可用于IsdB_(137-361)相关抗原疫苗的免疫牛血清抗体检测。