幽门螺杆菌热休克蛋白B亚单位的克隆和序列分析

幽门螺杆菌是消化道疾病的主要致病菌。其有效抗原成份热休克蛋白B亚单位 (HspB)可刺激机体产生保护性的免疫反应。用高保真PCR扩增系统扩增出HspB基因片段 ,将其克隆至质粒PUC19中 ,对其全序列进行了测定。克隆的HSpB基因序列与报道的序列完全一致。这一研究获得了序列正确的HspB基因 。

藏羊源细粒棘球蚴抗原B亚单位2蛋白生物信息学分析及其结构和功能预测

为进一步探索藏羊源细粒棘球蚴抗原B亚单位2蛋白(EgAgB8/2)功能,用DNAstar软件对EgAgB8/2重组基因序列进行分析并推算出其编码的氨基酸序列;通过蛋白分析系统ExPASY的在线软件Prot Param和Proscale,分析EgAgB8/2蛋白的物理和化学性质;用Signal P4.1软件对蛋白质信号肽进行预测。用TMHMM软件对EgAgB8/2蛋白的跨膜区进行分析。通过DNAstar分析EgAgB8/2蛋白质的二级结构。利用CBS分析系统上的Bepi Pred1.0b和DNAstar二者结合方式预测抗原表位。通过在线软件SWISS-MODEL预测三维结构。结果表明:EgAgB8/2重组基因335 bp的基因序列中,有一个273 bp开放阅读框,编码91个氨基酸。组成EgAgB8/2蛋白的有20种氨基酸,理论分子质量为10.35 ku,等电点为9.52,总平均亲水性为-0.247,蛋白总体亲水性较低,既含有信号肽序列又包括胞外区,结合两者的综合分析,确定EgAgB8/2蛋白抗原表位有:第21~27位,第47~48位,第82~88位。EgAgB8/2的结构和功能及其抗原表位的预测,为其在棘球蚴病的中间宿主免疫诊断方面的应用奠定了基础。

幽门螺杆菌热休克蛋白B亚单位的克隆和表达

幽门螺杆菌是消化道疾病的主要致病菌，其有效抗原成份热休克蛋白B亚单位（HspB)可刺激机体产生保护性的免疫反应，用高保真PCR扩增系统扩增出HspB基因片段，将其插入原核表达质粒pET22b(+)中，在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。经测序，克隆的HspB基因序列与报道的序列完全一致。SDS－PAGE凝胶电泳和Western Blotting免疫印迹分析检测发现，HspB基因表达的蛋白质分子量约为60kD,并证实该重组蛋白质可与兔抗幽门螺杆菌抗体血清发生反应，这一研究获得了序列正确的HspB基因，为将来以HspB分子为抗原的疫苗研制工作打下了良好的基础。

APOBEC3G对新型布尼亚病毒复制能力的影响

目的研究载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚单位3G(APOBEC3G)对新型布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)复制及IL-6生成的影响。方法首先通过慢病毒感染方式构建稳定过表达APOBEC3G的A549细胞,再使用人源SFTSV感染APOBEC3G过表达A549细胞;RT-qPCR检测细胞内的APOBEC3G、SFTSV-非结构蛋白编码基因(non-structural protein,NS)、白介素-6(IL-6)的mRNA表达量;流式荧光法检测细胞培养液上清中IL-6蛋白水平。结果SFTSV感染A549细胞可诱导APOBEC3G、IL-6 mRNA分别显著上调约100、800倍(P均<0.001);过表达APOBEC3G的A549细胞感染SFTSV后,细胞内SFTSV的NS mRNA表达下调57%(P=0.001)、IL-6 mRNA表达上调约58%(P=0.001),培养液上清中IL-6蛋白水平升高[对照组为(11257.92±274.36)pg/mL,过表达APOBEC3G组为(15150.65±215.54)pg/mL,P<0.001]。结论SFTSV感染细胞后APOBEC3G表达水平升高,过表达APOBEC3G可抑制SFTSV复制,并可促进IL-6的生成。

gyrB基因在细菌系统发育分析中的应用

细菌gyrB编码DNA促旋酶的B亚单位蛋白,对细菌DNA的转录和复制很重要。因不显现频繁的基因横向转移并且基于该序列的分析与DNA杂交同源性分析有较好的一致性,近年来常被选用于细菌系统发育分析及细菌鉴定,一般采用对该基因测序或对其PCR产物RFLP等方法进行研究。

ureI和ctB-ureI真核质粒构建及表达分析

目的：构建ureI和ctB—ureI真核表达质粒并分析其在细胞的表达情况。方法：用pIRES-RD2真核表达载体分别在5’端连接ureI和ctB—ureI基因，经双酶切和测序鉴定正确后，相应质粒用脂质体转染HEK293T细胞，用荧光显微镜观察荧光标签，确定质粒的转染率；用人抗幽门螺旋杆菌抗体和马抗CtB抗体，采用免疫荧光和免疫酶组织化学等方法研究该两种真核表达质粒在细胞中目的蛋白表达情况。结果：成功构建了ureI和ctB—ureI的真核表达质粒pIRES—RD2-ureI和pIRES-RD2-ctB—ureI，用此质粒转染HEK293T细胞48～72h后，荧光显微镜显示该两种质粒的转染率约为80％；用免疫荧光和免疫酶组织化学方法表明了该两种基因均能在HEK293T细胞表达并有免疫反应性，表达的ureI主要分布在胞质内或细胞膜附近，ctB—ureI在CtB信号肽引导下分布于HEK293T细胞质、细胞膜附近以及细胞外。结论：成功构建了真核载体pIRES2-DsRed2-ureI和pIRES2-DsRed2-ctB—ureI，目的蛋白表达于HEK293T细胞胞质内并有一定免疫反应性。

SARS-CoV核蛋白和宿主细胞相互作用的初步研究

寻找与SARS-CoV核蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,从而探索SARS-CoV的致病机理。可溶性表达SARS-CoV核蛋白,利用His标签和离子交换层析对表达的蛋白进行了纯化,获得较纯的可溶性核蛋白。再将SPR/BIA技术与MALDI-TOF MS技术结合起来,使用SPR生物传感芯片作为亲和吸附的表面,分别捕获2BS细胞和A549细胞裂解液中与SARS-CoV核蛋白相互作用的细胞蛋白,收集足够量的相互作用蛋白,再利用MALDI-TOF-MS分析获得蛋白的性质。结果鉴定出与SARS-CoV核蛋白相互作用的蛋白:26S蛋白酶调节亚单位S10B(蛋白酶体亚单位p42)(蛋白酶体26S亚单位ATPase 6)(P62333),属于泛素/蛋白酶体系统;目前国内外尚未见类似报道。此研究初步发现了一种与SARS-CoV核蛋白在细胞外相互作用的蛋白,但这种相互作用在SARS-CoV感染及SARS的发生发展中发挥的作用还有待于深入研究和探索。

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因克隆表达及临床应用

目的 获得重组表达的人幽门螺杆菌 (Hp)尿素酶B亚单位蛋白 (UreB) ,并将其运用于Hp感染的临床检测。方法 应用聚合酶链反应 (PCR)技术从临床分离的Hp菌株基因组中扩增出编码UreB的基因 (ureB) ,将其克隆于质粒PinPointTMXa Ⅲ上进行序列分析和蛋白表达 ,通过亲和层析得到纯化的重组UreB蛋白并用于 113例消化性溃疡患者Hp感染的酶联免疫吸附试验 (ELISA)法检测。结果 克隆的ureB基因核苷酸序列与GenBank公布的序列相比较 ,同源性为 96 .44 % ,推定氨基酸序列同源性为 99 6 5 %。纯化的重组UreB蛋白相对分子量约为 6 6 0 0 0 ,纯度为 90 %以上 ,并保持较好的免疫原性。应用纯化的重组UreB蛋白联合ELISA法检测 113例消化性溃疡患者Hp感染的灵敏度和特异性分别为 92 .0 %、98.5 %。结论 重组UreB蛋白作为抗原用于ELISA法检测Hp感染 ,保持了较高的灵敏度和特异性 ,可用于Hp感染的临床检测与诊断。

PSMB5对多发性骨髓瘤细胞增殖和硼替佐米耐药的影响及其机制研究

目的探讨蛋白酶体D5亚单位（PSMB5）基因对多发性骨髓瘤（MM）细胞增殖和硼替佐米（BTZ）耐药的影响及其机制。方法以MM细胞株RPMI8226细胞和BTZ耐药细胞株RPMI8226／BTZ100（简称BTZ100）细胞为研究对象，采用慢病毒转染的方法建立过表达和下调PSMB5表达的MM稳转细胞系；CCK8法检测PSMB5对MM细胞增殖和BTZ耐药性的影响；流式细胞术检测PSMB5对细胞凋亡的影响；Westernblot法检测PSMB5对凋亡相关基因Bax、Bcl-2、P—Akt和Cleavedcaspase．3表达的影响。结果①成功构建稳定过表达和下调PSMB5表达的RPMI8226和BTZ100细胞系。②PSMB5表达与RPMI8226和BTZ100细胞增殖呈正相关（P值均〈0．05）。③下调PSMB5表达后，在相同浓度的BTZ作用下RPMI8226细胞活力较对照组降低[作用24h时IC50分别为（7．01±0．47）、（9．64±0．55）nmol／L，t=6．289，P=0．003]，过表达后的细胞活力较对照组升高[IC50分别为（10．99±0．58）、（9．51±0．37）nmol／L，t=3．724，P=0．020]。④PSMB5表达可促进BTZ诱导的RPMI8226、BTZ100细胞凋亡，与对照组比较，差异均有统计学意义（P值均〈0．05）。⑤下调PSMB5表达可上调Bax和Cleavedcaspase-3表达，降低Bcl-2和p-Akt表达，而过表达则相反。结论下调PSMB5表达可通过激活凋亡信号通路促进MM细胞凋亡，增强MM细胞对BTZ的敏感性。提示PSMB5可能是治疗MM的潜在靶点。

草鱼出血病混合感染的嗜水气单胞菌的分离、鉴定与理化特性

从患出血病草鱼的肝脏病灶中分离筛选出2株致病菌。取病鱼样品组织过滤液接种CIK细胞、培养,电镜下观察到细胞质中含有草鱼呼肠孤病毒样颗粒和包涵体,病毒颗粒大小65nm～70nm,包涵体0.46μm～1.81μm。人工回归感染实验显示分离的菌株及细胞毒悬液均能使草鱼致病死亡。对分离菌株进行细胞形态学、理化特性分析及药敏试验,初步判定所分离的2株菌均为嗜水气单胞菌。进一步对菌株进行DNA分子鉴定,结果显示2株菌的16SrRNA基因、促旋酶亚单位蛋白(gryB)基因均与GenBank上的嗜水气单胞菌相应的基因具有较高的同源性。在根据已知序列分别构建的2个基因的分子系统进化树中2株菌均与嗜水气单胞菌聚类。同时2个菌株均可扩增到气溶素基因(aerA)和丝氨酸蛋白酶基因(ahpA),提示它们均可能为嗜水气单胞菌强毒株。综合人工回归感染实验与毒力基因鉴定结果可认为所分析的草鱼出血病病例存在着病毒与嗜水气单胞菌的混合感染。