1株兔源A型产气荚膜梭菌毒力和免疫原性测定

在兔场中发现一只疑似感染了产气荚膜梭菌病兔,从该兔的病理组织中分离到1株兔源产气荚膜梭菌,对分离株进行血清学分型。毒力以及免疫原性检测。结果表明:该分离株血清型为A型,该分离株肉肝胃酶消化汤培养液的无菌毒素对小鼠和家兔均有毒力、对小白鼠的最小致死量为0.05 m L/只,对家兔的最小致死量为1.5 m L/只。按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(以下简《规程》)方法制备疫苗进行效力检验,免疫保护率不低于80%。

1株猪源A型产气荚膜梭菌的分离鉴定及致病性研究

【目的】探究A型产气荚膜梭菌在仔猪腹泻中的致病性,为A型产气荚膜梭菌感染所致腹泻的诊断和治疗提供理论依据和参考。【方法】通过培养特性和革兰染色镜检对分离菌进行初步鉴定,通过生化试验、毒素基因PCR扩增、16S rRNA序列比对并构建进化树对可疑菌株进一步鉴定,利用药敏试验和动物回归试验研究分离菌株的耐药性和致病性。【结果】分离菌株在TSN平板上呈黑色菌落,在血平板上呈α、β双溶血环,革兰染色呈紫色粗大杆菌。生化试验结果显示,分离菌株葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、还原性硝酸盐试验、H_2S试验和明胶液化均呈阳性,甘露醇、吲哚试验和水杨酸结果呈阴性。16S rRNA序列比对结果显示,分离菌与NCBI数据库中已公布的产气荚膜梭菌16S rRNA基因序列相似性均>99%,鉴定该菌株为产气荚膜梭菌。PCR扩增出plc及cpb2基因,表明该菌株为携带β2毒素的A型产气荚膜梭菌。药敏试验结果显示,分离菌株对青霉素G、庆大霉素、林可霉素、磺胺异噁唑、环丙沙星、诺氟沙星耐药。动物回归试验结果显示,攻菌后仔猪粪便中可检出大量产气荚膜梭菌,该菌株可引起仔猪腹泻,死亡率达50%;死亡仔猪剖检可见小肠充血、出血、鼓气,从脾脏、小肠中可分离出产气荚膜梭菌,且在损伤严重的空肠肠段中分离出高载量A型产气荚膜梭菌。【结论】本试验成功分离出1株A型产气荚膜梭菌,可引起新生仔猪发病,致病性较强,该研究结果为A型产气荚膜梭菌感染仔猪的诊断、流行病学调查、治疗提供了参考依据。

鸭肠炎病毒和A型产气荚膜梭菌共感染绿壳蛋鸭十二指肠代谢组学分析

旨在探究鸭肠炎病毒(DEV)和A型产气荚膜梭菌(CpA)共感染绿壳蛋鸭114 h时十二指肠的差异代谢物变化。试验选取12只健康绿壳蛋鸭,随机分为对照组(CK)和共感染组(TCD)。通过临床观察、剖检病理观察以及PCR检测确定DEV和CpA共感染成功,再使用液相色谱-质谱联用(LC-MS)检测CK组和TCD组感染114 h时鸭十二指肠的代谢物变化,筛选潜在差异代谢物及代谢通路。结果表明,与CK组相比,TCD组鸭十二指肠感染114 h时的总差异代谢物29种,主要有5′-s-甲基-5′-硫腺苷、胞苷、脱氧皮质酮21-葡萄糖苷、腐胺和2-氧吲哚、腐胺、柚皮素、2-氧吲哚、吲哚-3-乙醛等;差异代谢物通过KEGG通路富集分析,共显著富集到22条代谢通路,主要有烟酸酯和烟酰胺代谢、半胱氨酸和蛋氨酸的代谢、酪氨酸代谢、色氨酸代谢、甘油磷脂代谢等,其中与机体免疫和炎症相关的有腐胺、柚皮素、2-氧吲哚、吲哚-3-乙醛、5′-s-甲基-5′-硫腺苷、烟酸脂和半胱氨酸-蛋氨酸代谢、色氨酸代谢和烟酰胺代谢等。综上所述,DEV和CpA共感染绿壳蛋鸭后,可能通过影响腐胺和柚皮素等代谢物以及色氨酸代谢和半胱氨酸-蛋氨酸代谢通路来影响绿壳蛋鸭十二指肠的炎症,为阐明DEV和CpA共感染机制提供科学依据。

苦参碱对A型产气荚膜梭菌致小鼠肠炎的预防和治疗效果

为研究苦参碱对A型产气荚膜梭菌致小鼠肠炎的预防和治疗效果,本实验将56只8周龄的健康雄性昆明小鼠均分为对照组、菌液组、治疗组和预防组。菌液组小鼠以0.2 mL/只灌胃A型产气荚膜梭菌(1×10~9cfu/mL)16 d,治疗组小鼠于灌胃A型产气荚膜梭菌7 d后灌服苦参碱(30 mg/kg)9 d,预防组小鼠则以A型产气荚膜梭菌菌液和苦参碱同时灌胃16 d,对照组小鼠则每日每只灌服PBS 0.2 mL至16 d。对各组小鼠称重采血后剖杀、收集回肠组织制备病理切片观察组织病变,并分离血清,利用ELISA试剂盒对血清中的炎性细胞因子进行检测,采集肠内容物,经PCR检测后灰度分析A型产气荚膜梭菌的数量,采用ELISA试剂盒测定α毒素含量。结果显示治疗组和预防组小鼠的体质量明显增加;菌液组小鼠肠道小肠绒毛脱落,淋巴细胞和红细胞的数量增加,而预防组和治疗组的肠道炎性细胞浸润减少,肠绒毛结构逐渐恢复,炎症引起的肠组织损伤得以修复。ELISA检测结果显示,预防组小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、MAPK8的含量与对照组之间无显著性差异(P>0.05);治疗组小鼠血清中IL-6和MAPK8含量显著高于对照组(P<0.05)。PCR检测后灰度分析结果显示,治疗组和预防组小鼠肠内容物A型产气荚膜梭菌的数量与菌液组无显著差异(P>0.05),但与对照组比较,上述两组小鼠释放的A型产气荚膜梭菌α毒素含量明显降低。上述结果表明苦参碱可抑制A型产气荚膜梭菌释放ɑ-毒素,并可恢复小鼠回肠黏膜免疫屏障,降低荚膜梭菌所引起小鼠的肠道炎症。本研究为苦参碱应用于A型产气荚膜梭菌所致肠炎的治疗和预防提供参考依据。

G型产气荚膜梭菌的分离鉴定及黄羽肉鸡发病模型的建立

为筛选鸡源G型产气荚膜梭菌(Cp)强毒菌株并建立黄羽肉鸡坏死性肠炎(NE)的发病模型,本研究从国内不同地区采集292份鸡肠道及粪便样品,其中健康鸡样品154份,疑似患NE鸡样品138份,经TSC-卵黄平板分离及16S rRNA基因的PCR扩增及测序鉴定,采用多重PCR扩增分离Cp的毒素基因(α、β、ε、ι毒素、肠毒素和坏死性肠炎毒素B(NetB),以确定分离株的毒素分型。结果显示,共获得86株Cp,其中3株从健康鸡样品中获得,83株从患病鸡样品中获得。毒素分型的PCR结果显示,分别出现约900 bp(α毒素)、550 bp(β毒素)、738 bp(NetB毒素)的目的条带;未扩增到ε毒素、ι毒素及肠毒素(506 bp);经统计后结果显示,18株Cp为A型(20.39%),12株为C型(13.95%),56株为G型(65.12%)。选择其中10株生长较好的G型Cp,通过腹腔注射0.2 mL(1×109cfu/mL)感染小鼠以评估其致病性,结果显示G型Cp分离株CpZZ2、CpDYC1和CpZD1的致病性均较强。将一日龄黄羽肉鸡分成8组,1组~6组为实验组,7组为球虫对照,8组为阴性对照,相应组别黄羽肉鸡于10日龄时经口灌服感染巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)孢子化卵囊,13日龄更换为高蛋白饲料,14日龄分别经口灌服感染G型Cp CpZZ2和CpDYC1株,其中两组鸡连续3 d感染上述两株G型Cp,以构建鸡NE发病模型。在17 d的观察期内统计各组肉鸡的存活率、相对增重率。同时剖杀所有鸡,根据肠道病变评分标准评价各组鸡的肠道病变,筛选致鸡NE的最佳组合。结果显示,通过上述标准判定使用巨型艾美耳球虫(1×104个孢子化卵囊)+高蛋白饲料(蛋白含量35%)+梭菌(CpZZ2)组的鸡急性NE发病模型成功构建,该组鸡因NE引起的死亡率可达50%,剖检后该组鸡肠道出现充气增粗、肠道内容物为红褐色豆腐渣样物等NE典型病变,而高蛋白饲料+Cp(CpZZ2)组及连续感染Cp组鸡虽不致死鸡,但该两组鸡小肠肠道也出现NE相关病变,可能为亚临床感染,其余各组鸡均无死亡和明显临床症状。本研究从临床分离并筛选的G型Cp强毒菌株,联合球虫感染和高蛋白饲料,诱发了黄羽肉鸡的NE,建立了黄羽肉鸡NE的发病模型,为进一步研究我国黄羽肉鸡NE的发病机制及疫苗研发奠定了基础。

绵羊大肠杆菌与A型产气荚膜梭菌混合感染的病原分离鉴定

试验旨在对宁夏一绵羊场疑似大肠杆菌与A型产气荚膜梭菌混合感染的死亡病例进行确诊并提出相应的防治方案。采用产气荚膜梭菌显色培养基及伊红美蓝固体培养基进行病原分离培养,对分离菌株进行16S rRNA基因序列PCR检测,依据16S rRNA序列构建分离株分子进化树;之后对大肠杆菌分离株毒素因子进行PCR检测,对产气荚膜梭菌分离株进行毒素分型鉴定。结果显示,分离株PCR检测获得了16S rRNA特异性条带;分子进化树结果显示,大肠杆菌分离菌株NXDC001与大肠杆菌在同一分支,产气荚膜梭菌分离菌株NXSJ001与产气荚膜梭菌在同一分支。大肠杆菌分离株检测出毒素因子HPI(irp2)及LEE(eae);产气荚膜梭菌分离株携带毒素因子cpa,证明分离株为A型产气荚膜梭菌。研究表明,试验成功分离鉴定大肠杆菌及A型产气荚膜梭菌各一株,证明病死羊为大肠杆菌及A型产气荚膜梭菌混合感染。

G型产气荚膜梭菌的分离鉴定及其在鸡坏死性肠炎发病模型中的应用

目的:探讨不同诱导因素对鸡坏死性肠炎(Necrotic enteritis,NE)的诱发效果,以便建立鸡坏死性肠炎的发病模型。方法:以安徽省某规模化鸡场采集的病鸡肠道样品中分离出的G型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringens)(CPG-AH5株)为病原菌,分析单独或联合感染毒害艾美耳球虫对在饲喂高蛋白饲料(添加鱼粉)和不饲喂高蛋白饲料条件下,诱发鸡坏死性肠炎的影响。结果:无诱导因素时,1.1×10^(9)CFU/mL剂量下CPG-AH5株感染可造成肠道损伤(平均病变评分为1.5±0.85分);单一诱导因素(鱼粉或球虫)不能有效促进CPG-AH5株的感染,肠道病变与无诱导因素条件下无显著性提高(2.0±1.15、2.4±1.08,P>0.05);多个诱导因素(鱼粉和球虫)联合诱导可有效促进CPG-AH5株的感染,与无诱导因素和单一诱导因素相比肠道病变显著性提高(3.6±0.52,P<0.001)。结论:鱼粉和球虫联合诱导可显著促进G型产气荚膜梭菌的感染,提高肠道病变。本研究建立了一种鸡坏死性肠炎发病模型,有利于对鸡坏死性肠炎发病机制的研究,为疫苗及药物的后续研发和筛选评价提供了新的技术支撑。

新疆哈密市羊源产气荚膜梭菌流行病学调查

【目的】由产气荚膜梭菌引起的家畜疾病给绵羊养殖业的健康发展带来了巨大损害,为了解哈密市绵羊产气荚膜梭菌的流行情况,以便有针对性地对绵羊产气荚膜梭菌病开展防控。【方法】采集哈密市两县一区重点监测网点和规模养殖场的新鲜绵羊粪便,通过聚合酶链式反应(PCR)方法对绵羊中产气荚膜梭菌的感染情况开展调查,然后运用显微镜镜检“、牛乳发酵”试验和DNA琼脂糖凝胶电泳等技术对检测阳性菌进行形态学与分子生物学鉴定。【结果】研究显示,绵羊粪样中产气荚膜梭菌的总检出率为11.34%;不同地区的阳性感染率不同,阳性率最高为19.04%;在33份阳性样品中,72.73%为A型株,27.27%为D型株,未见B、C、E型。【结论】哈密市的绵羊普遍存在产气荚膜梭菌感染,且A型、D型为该地羊源产气荚膜梭菌的流行菌株,本研究为哈密市产气荚膜梭菌的诊断和防控提供了一定的数据支撑。

肉牛产气荚膜梭菌中毒死亡病例的诊断

产气荚膜梭菌是一种重要的人兽共患病原菌,常引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症,突发死亡。云南省昆明市某肉牛养殖场犊牛突发呼吸急速、腹痛、步态不稳,腹部臌胀,随后死亡。剖检主要病变为胸腔积液、肺气肿、肠系膜树枝状出血、胃肠内容物糊状且充满大量酸臭气体等,经采集死亡犊牛大肠、小肠及其内容物,采用SN-T 2709-2010国境口岸产气荚膜梭菌毒素检测方法对其进行毒素检测,结果显示α毒素基因、β毒素基因、肠毒素基因均为阳性,初步判定为产气荚膜梭菌C型。本次病例诊断提示在云南省存在肉牛产气荚膜梭菌C型感染,肉牛养殖场应加强对产气荚膜梭菌疾病的预防。

A型产气荚膜梭菌感染鸭回肠代谢组学分析

旨在应用非靶向代谢组学技术探究A型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type A,CpA)感染鸭回肠差异代谢物变化特征。试验选取CpA感染37日龄健康雏鸭,采用剖检病理观察和PCR检测确定CpA感染成功后,使用液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)技术检测对照组和CpA感染组感染66、90、114 h时鸭回肠的代谢组学,筛选并分析潜在的差异代谢物及相关代谢通路,最后选取对照组和CpA感染114 h组差异代谢物验证。结果表明:经剖检病理观察和病原核酸检测确定成功构建了鸭CpA感染模型;PCA图中回肠样本有部分重叠,提示感染组与对照组鸭回肠间可能存在相同的离子化合物;感染鸭66、90和114 h总差异代谢物种类分别有14、16和24种,富集的代谢通路分别有13、14和28条,主要集中在花生四烯酸代谢,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、酪氨酸代谢等;同时差异代谢物验证结果显示,感染114 h回肠缬氨酸和丙氨酸含量变化趋势均与非靶向代谢组学检测结果一致。综上所述,CpA感染鸭的致病机制可能通过影响相关氨基酸的代谢通路,调控相关代谢产物的合成。

动物源A型产气荚膜梭菌流行情况调查及α毒素基因分析

产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患病原菌,在一定条件下可引起多种严重疾病。为了调查不同动物A型产气荚膜梭菌流行情况及α毒素基因同源性,本试验从不同地区共采集病料307份,其中鸡133份(包括肉鸡112份、蛋鸡21份)、鸭65份、犬31份、猪14份、兔子20份、小鼠9份、牛粪便18份、鸵鸟粪便17份。取肠道内容物和粪便进行产气荚膜梭菌分离鉴定和毒素基因分型,并检测cpe、β2毒素基因携带率;从不同地区、不同动物源A型产气荚膜梭菌分离株挑选18株进行α毒素基因扩增,将所得基因序列进行同源性比较。结果显示,307份样品中68份(22.1%)呈产气荚膜梭菌阳性,不同动物源产气荚膜梭菌阳性率介于5.9%~44.4%;68株产气荚膜梭菌分离株α毒素基因阳性率为100%,所有分离株毒素基因分型均为A型,未检测到cpe毒素基因,β2毒素基因总阳性率为63.2%;分离株与NCBI参考菌株α毒素基因相似性介于97.8%~100%。结果表明,不同动物α毒素具有很高的同源性,本调查为研发A型产气荚膜梭菌α毒素通用疫苗提供数据支持。

G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备及其免疫保护效果的评价

为研制G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗,本研究将G型产气荚膜梭菌菌株(7a9-2、D3-2)增菌培养后接种产毒培养基高效产毒,除菌后获得外毒素,经粗提后进行SDS-PAGE检测。结果显示:制备的G型产气荚膜梭菌外毒素含有α、NetB两种毒素蛋白。将两株G型菌株所产外毒素经2倍倍比稀释后经腹腔注射小鼠,检测外毒素的致病性,结果显示7a9-2菌株所产外毒素毒力较强,可作为疫苗候选株。因此选择7a9-2菌株制备外毒素,并经甲醛灭活后制备G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗,经检验合格后免疫三黄鸡。免疫后5周内,每周随机选取10只鸡采血分离血清,采用ELISA方法检测鸡血清中的抗体效价。结果显示,免疫组鸡血清稀释100倍后,一免组鸡的抗体效价最高可达6.83log2,二免组鸡抗体效价最高可达8.34log2,免疫后鸡体内可产生较高水平的抗G型产气荚膜梭菌的抗体。免疫后实验鸡通过口服鸡球虫卵囊和G型产气荚膜梭菌菌液进行攻毒试验,结果显示,攻毒后免疫组鸡肠道病变程度和发病率均显著低于对照组(P<0.05)。在整个实验过程中观察各组鸡的生长情况,计算鸡平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G),以评估疫苗对鸡生长性能的影响。结果显示,免疫组鸡ADG显著高于对照组鸡(P<0.05),免疫组鸡与对照组鸡的ADFI无明显差异(P>0.05),免疫组鸡F/G显著低于对照组鸡(P<0.05)。上述结果首次表明,本研究制备的G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗免疫鸡后可显著降低由该菌引起的坏死性肠炎的发病率,且对鸡生长性能有显著提高作用。本研究制备的G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗为防控鸡的坏死性肠炎提供了可靠手段,且该疫苗具有良好的应用前景。

C型产气荚膜梭菌感染鹿肠道中关键基因和途径的转录组分析

鹿的产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringens)病主要表现为肠毒血症,致死率高。本研究旨在探究C型产气荚膜梭菌感染鹿肠道的关键基因和途径。通过构建C型产气荚膜梭菌感染鹿空肠结扎环模型,HE染色检测C型产气荚膜梭菌感染后空肠的病理学变化,采用Illumina NovaSeq对C型产气荚膜梭菌感染鹿肠道进行转录组测序,并利用qPCR技术进一步验证部分差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs);最后通过STRING网站预测多基因蛋白互作网络。结果显示:形态学分析显示,产气荚膜梭菌感染后鹿肠道组织出现明显的坏死和出血。转录组分析显示,一共存在705个差异表达基因,其中,在感染组肠道中有276个上调的差异基因,有429个下调的差异基因。GO富集分析显示,DEGs主要富集在生物调节、对刺激的反应和免疫系统过程;KEGG富集分析显示,DEGs富集的通路主要是T细胞受体信号传导途径、Toll样受体信号通路和造血细胞谱系等,造成肠道损伤和出血,促进鹿肠毒血症的进程。此外,qPCR结果证实了分析结果准确可信。DEGs蛋白互作分析结果表明TLR6、CLDN1、CD3E、IL1A和CCL20与其他蛋白有较多互作关系,并且GO分析和KEGG分析显著富集的通路高度重合。其中,TLR6可能通过抑制紧密连接蛋白表达和免疫炎症反应在鹿产气荚膜梭菌诱导的肠毒血症中发挥关键作用。综上所述,C型产气荚膜梭菌通过破坏细胞膜,并抑制紧密连接蛋白表达,诱导免疫炎症反应,造成肠道出血和损伤。本研究为鹿感染产气荚膜梭菌后调控的分子机制提供了新的思路,为该病的治疗提供理论基础。

C型产气荚膜梭菌性腹泻仔猪脾脏转录组分析

旨在获得C型产气荚膜梭菌性腹泻仔猪血清炎症因子含量、脾脏病理变化及转录组表达谱特征,为其防治提供参考。选择健康状况良好、体质量相近的7日龄二元仔猪6头,随机分为2组,即对照组(CS)和处理组(TS)。TS组每头仔猪每天灌服1 mL菌液(1×109 cfu/mL),连续5 d,CS组仔猪灌服不含菌液的培养液,感染后0,1,3,5 d采集血液分离血清,用ELISA方法检测IL-8、IFN-α和IFN-γ含量。试验结束后屠宰仔猪采集脾脏,进行HE染色和RNA-Seq测序,对测序获得的差异表达基因进行GO功能和KEGG信号通路富集分析,并采用RT-qPCR检测仔猪感染C型产气荚膜梭菌过程中关键差异表达基因的表达量。结果表明:TS组仔猪脾脏出现明显炎症,中性粒细胞浸润,伴有变性及坏死的实质细胞;第3,5天CS组血清中IL-8、IFN-α和IFN-γ含量极显著低于(P<0.01)TS组;TS组与CS组间有1079个差异表达基因,上调583个,下调496个;差异表达基因富集的GO功能主要有细胞对β干扰素的反应、细胞对DNA损伤刺激的反应、炎症反应的负调控等,富集的KEGG信号通路主要有肺结核、乙型肝炎、B细胞受体等;抵抗C型产气荚膜梭菌感染的候选基因(如JAK3、TLR3、ILF2、CXXC1等)RNA-Seq结果与RT-qPCR结果一致。以上结果表明,JAK3、TLR3等基因通过关键信号通路可能在仔猪脾脏抵抗C型产气荚膜梭菌感染过程中发挥了重要功能。

鸭肠炎病毒与A型产气荚膜梭菌共感染鸭回肠代谢组学分析

【目的】探究鸭肠炎病毒(DEV)和A型产气荚膜梭菌(CpA)共感染的致病机制。【方法】研究选取37日龄健康非免疫雏鸭,随机分为对照组与共感染组。共感染组鸭于每天早晚各进行1次灌胃,每次灌CpA菌液8 mL(1×108 CFU/mL),连续5 d,首次灌胃72 h后于腿部肌肉接种DEV-GZ株病毒液(0.2 mL/只,TCID 50=3.16×10-9 TCID 50/0.1 mL),对照组接种灭菌生理盐水0.2 mL,观察鸭临床病变及回肠剖检病变,采用细菌分离鉴定和PCR等方法检测DEV和CpA共感染模型是否成功建立。采集感染90 h对照组与共感染组回肠,采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术对对照组及共感染组感染90 h鸭回肠进行代谢组学检测,筛选并分析潜在的差异代谢物及相关信号通路。【结果】经检测确定成功构建了鸭DEV和CpA共感染模型。对照组与共感染组鸭回肠差异代谢物质共有36种,在正离子模式下共有16种差异代谢物质,主要为2′-脱氧肌苷、腐胺、8(z),11(z),14(z)-二十碳三烯酸、胞苷和1-油酰基外消旋甘油,在负离子模式下共有20种差异代谢物质,主要为油酸、花生四烯酸、11(z),14(z)-二十二碳二烯酸、二十二碳三烯酸和亚油酸;差异代谢物主要富集的代谢通路为10条,主要为色氨酸代谢、嘧啶代谢、嘌呤代谢等。【结论】11(z),14(z)-二十二碳二烯酸、二十二碳三烯酸和花生四烯酸可成为DEV和CpA共感染鸭回肠的敏感生物标记物,提示DEV与CpA共感染加剧雏鸭回肠炎症,色氨酸代谢通路提示DEV与CpA共感染鸭免疫力变化存在联系。本研究为阐明DEV与CpA感染的致病机制奠定基础。

携带非典型cpb2基因牛源A型产气荚膜梭菌重组α毒素的免疫保护性研究

为验证重组α毒素对携带非典型cpb2基因的A型产气荚膜梭菌的免疫保护性,本研究应用PCR技术,从某牛场牛源A型产气荚膜梭菌G1分离株中扩增出1 194 bp的α毒素编码基因(cpa)和795 bp的β2毒素编码基因(cpb2)。经BLAST分析显示,G1分离株携带的cpb2基因与14个菌株的非典型cpb2基因的氨基酸序列同源性为95.1%～98.9%,与典型cpb2基因(L77695)的氨基酸序列同源性为61.7%。这表明,G1的cpb2基因为非典型cpb2基因。同时分别将cpa和cpb2基因扩增产物克隆于原核表达载体中,构建重组表达质粒pET-a和pET-b2,重组菌经IPTG诱导表达重组蛋白,将其纯化后单独及联合免疫小鼠进行免疫保护试验。结果显示,单独免疫重组α毒素蛋白组以及联合免疫重组β2毒素蛋白组的小鼠,均可以抵抗至少6倍最小致死量(MLD)的G1外毒素(包含α毒素和非典型β2毒素)的攻击,也可以完全抵抗至少6 MLD的G2外毒素(不包含β2毒素)的攻击。表明,重组α毒素蛋白对含有及不含有非典型β2毒素的A型产气荚膜梭菌均具有良好的免疫保护作用。

A型产气荚膜梭菌tetB(P)耐药基因核苷酸序列与蛋白结构分析

为了对产气荚膜梭菌tetB(P)耐药基因进行分析,通过生物软件设计引物,扩增A型产气荚膜梭菌tetB(P)耐药基因,测序后对tetB(P)基因核苷酸序列与蛋白结构进行分析.结果表明:分离株tetB(P)基因长度为1 959bp,编码652个氨基酸.与参考菌株CW92、EHE-NE18的核苷酸序列同源性依次为99.7%、99.9%,氨基酸序列同源性依次为99.4%、99.8%.分离株tetB(P)蛋白亲水性氨基酸较多,无跨膜区,含有4个N-糖基化位点,1个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点,9个蛋白激酶C磷酸化位点,12个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,7个N-豆寇酰化位点,1个ATP/GTP结合位点基序,1个翻译型鸟苷酸结合域,三级结构主要是由α-螺旋、β折叠和无规则卷曲形成.

产气荚膜梭菌B型C58-1株β1毒素基因的克隆表达

利用PCR技术,从B型产气荚膜梭菌中国标准株C58-1株扩增出β1毒素基因,连接pMD18-T载体筛选阳性克隆,然后用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ对其进行酶切,回收927bp的β1毒素基因片段,将其定向克隆到载体pET-32a中,获得重组质粒pETβ927。将pETβ927转化至受体菌BL21(DE3)中,其表达产物经His-Trap FF预装柱纯化、SDS-PAGE检测目的蛋白大小和分布及Western blotting检测其反应原性。结果表明,完整的β1毒素基因大小为1 011bp,与GenBank发表的B型和C型产气荚膜梭菌β1毒素蛋白序列同源性达99.4%以上;SDS-PAGE结果显示重组目的蛋白在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白大小为54ku,在超声波裂解上清和包涵体中均有分布,但以包涵体为主。Western blotting检测结果显示表达的重组蛋白可与特异性血清抗体发生免疫反应,表明β1毒素蛋白具有较好的反应原性。

C型产气荚膜梭菌重组菌株BL21(DE_3)pXETAB_2B_1表达条件的优化

目的优化C型产气荚膜梭菌重组菌株BL21(DE3)pXETAB2B1融合蛋白表达的条件。方法以IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)为诱导剂,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳比较pH值、培养温度、诱导时间、菌体生长密度等因素对重组α-β2-β1融合蛋白表达进行表达条件的影响。结果C型产气荚膜梭菌重组菌株BL21(DE3)pXETAB2B1的表达优化条件是:最适培养基pH值是7.5,最适诱导时间是5小时,最适表达温度是37℃,最适菌体生长密度是OD6001.0,IPTG最适诱导浓度是0.4 mmol/L。结论获得C型产气荚膜梭菌重组菌株BL21(DE3)pXETAB2B1融合蛋白的最佳表达条件。

B型产气荚膜梭菌三种主要毒素基因的PCR检测

为了对B型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type B)进行快速检测,依据NCBI登录的产气荚膜梭菌α、β及ε毒素基因序列设计引物,并对其进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳结果显示3个毒素基因均被成功扩增,目标片段条带清晰,长度与预期相符。