产气荚膜梭菌B型C58-1株β1毒素基因的克隆表达

利用PCR技术,从B型产气荚膜梭菌中国标准株C58-1株扩增出β1毒素基因,连接pMD18-T载体筛选阳性克隆,然后用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ对其进行酶切,回收927bp的β1毒素基因片段,将其定向克隆到载体pET-32a中,获得重组质粒pETβ927。将pETβ927转化至受体菌BL21(DE3)中,其表达产物经His-Trap FF预装柱纯化、SDS-PAGE检测目的蛋白大小和分布及Western blotting检测其反应原性。结果表明,完整的β1毒素基因大小为1 011bp,与GenBank发表的B型和C型产气荚膜梭菌β1毒素蛋白序列同源性达99.4%以上;SDS-PAGE结果显示重组目的蛋白在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白大小为54ku,在超声波裂解上清和包涵体中均有分布,但以包涵体为主。Western blotting检测结果显示表达的重组蛋白可与特异性血清抗体发生免疫反应,表明β1毒素蛋白具有较好的反应原性。

B型产气荚膜梭菌C58-1株ε毒素基因序列分析与可溶性表达

利用PCR技术从B型产气荚膜梭菌扩增出ε毒素基因,然后用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ对其进行酶切,回收984bp的ε毒素基因片段,将其定向克隆在载体PET-32a中,获得重组质粒pETε984。将pETε984转化至受体菌BL21(DE3)中。重组菌株经IPTG诱导后,其表达产物经SDS-PACE分析。结果表明,重组目的蛋白在大肠埃希菌成功表达,融合蛋白大小为51ku,存在于细菌培养上清中,可溶性蛋白占菌体总蛋白相对含量的67.8%。序列分析表明C58-1株ε毒素蛋白序列与目前公布的所有B型和D型产气荚膜梭菌同源性均在99.7%以上,但ε毒素蛋白序列第321位出现了S→Y突变。研究结果为ε毒素蛋白的亚单位疫苗研究奠定了基础。