自建Lowry法测定B型肉毒神经毒素蛋白质含量

目的:探究适宜的B型肉毒神经毒素中蛋白质含量测定方法。方法:分别应用《中国药典》四部(2020版)中蛋白质测定法项下福林酚法(药典方法)和自建的Lowry法(本方法)测定3批B型肉毒神经毒素中的蛋白质含量,比较两种方法的线性关系、精密度和准确度。结果:两种方法的线性都具有良好的相关性,药典方法和本方法线性绝对系数R2分别为0.9972和0.9987;两种方法都具有良好的精密度和重复性,但本方法的相对标准偏差更低。结论:自建的Lowry法更适合B型肉毒神经毒素中蛋白质含量的测定。

鼠源抗B型肉毒毒素单链抗体噬菌体文库的构建筛选及抗体免疫学活性的初步研究

B型肉毒毒素重链C-端片段(BoNTB/Hc)经金属螯和层析法纯化后免疫Balb/c小鼠,从其脾淋巴细胞中提取总RNA,反转录成cDNA,用抗体可变区混合引物进行全套抗体重、轻链可变区基因的扩增,体外随机装配成单链抗体(scFv)。将其克隆至pCANTAB5E中,构建单链抗体噬菌体抗体库。结果表明经过4轮"吸附-洗脱-扩增"的富集过程,筛选获得高亲和力的克隆。序列测定符合抗体可变区结构特点。

B型肉毒毒素保护性抗原Hc在大肠杆菌中的可溶性高表达

目的:通过序列优化及表达条件改进,在大肠杆菌中高效可溶性表达B型肉毒毒素保护性抗原Hc(Bont/B-Hc)。方法:对Bont/B-Hc基因片段优化,用大肠杆菌常用密码子替换稀有密码子,并将(G+C)含量由76.2%降至56.3%;人工合成多条具有重叠互补序列的寡核苷酸片段,采用重叠延伸PCR方法获得了Bont/B-Hc的全长基因,并构建了原核可溶性表达载体;将经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导Bont/B-Hc的表达并进行纯化及Western印迹鉴定。结果和结论:目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性高表达,占菌体裂解液上清总蛋白的26.7%,表达量达到30mg/L,是目前国内外已知表达的最高水平;经Ni柱一步纯化后,目的蛋白纯度可达到80.3%,为肉毒毒素中和抗体的制备及亚单位疫苗的研究奠定了基础。

B型肉毒毒素受体结合区C片段在大肠杆菌中的表达及免疫原性研究

目的:在大肠杆菌中表达、纯化B型肉毒毒素受体结合区C片段(BHc-C),研究其免疫原性。方法:将BHc-C基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达GST-BHc-C融合蛋白并通过亲和纯化;以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备免疫血清,采用ELISA检测免疫血清的效价并测定其抗B型肉毒毒素中和活性。结果:在大肠杆菌中表达了GST-BHc-C融合蛋白;以该融合蛋白免疫小鼠获得高效价免疫血清,且该免疫血清具有中和活性。结论:获得了GST-BHc-C融合蛋白,并证实其具有免疫原性。

我国及部分国家B型肉毒毒素的中毒情况

肉毒毒素是自然界中已知毒性最强的毒素,通常被分为A～G共7个血清型,其中A、B、E型是最常见的人类中毒型别。肉毒中毒的流行特点与菌体的地域分布、各地居民的饮食习惯和社会活动都有一定关系。目前,除南极洲外的世界各大洲均有B型肉毒中毒的报道。我国、日本及欧洲B型肉毒中毒主要为家庭自制食物引发的食源性中毒,而美国则主要为婴儿肉毒中毒。近年来,创口型B型肉毒中毒与"注射型吸毒人员"的关联引起了研究者的注意。为了加深对B型肉毒中毒的了解,我们对我国及部分国家和地区的B型肉毒中毒情况做简要介绍。

B型肉毒毒素单克隆抗体杂交瘤株的建立

[目的]制备、筛选稳定分泌B型肉毒毒素单抗的杂交瘤克隆,为相关研究提供工具。[方法]采用纯化的B型肉毒毒素免疫BALB/c小鼠,用免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合,筛选阳性克隆。[结果]得到10株稳定分泌B型肉毒毒素单抗的杂交瘤克隆,1株为IgM,其余9株分泌IgG,亚类为IgG2a。10株单克隆抗体均与B型肉毒毒素呈特异性反应,而与标准A型肉毒毒素无交叉反应,腹水单抗的效价均在105以上。[结论]10株杂交瘤细胞株均能分泌抗B型肉毒毒素单克隆抗体,为B型肉毒毒素的检测和研究提供了工具。

B型肉毒毒素重链C端基因的表达与保护作用的初步研究

肉毒毒素是肉毒梭状杆菌产生的外毒素,有7种血清型(A～G),是目前已知的毒性最强的细菌蛋白质。人类肉毒中毒主要是由A、B和E型引起。本研究克隆了B型肉毒毒素重链C端片段(Hc),在大肠杆菌中进行了诱导表达,并用Ni离子亲和柱进行了纯化。Hc蛋白免疫后的BALB/c小鼠可以抵抗6×103LD50B型肉毒毒素攻击。

鼠源抗B型肉毒毒素Fab抗体库的构建及初步筛选

目的:应用重组噬菌体抗体库技术制备抗B型肉毒毒素Fab抗体。方法:用重组B型肉毒毒素重链C端片段(BoNTB/Hc)免疫BALB/c小鼠,从其脾淋巴细胞扩增免疫球蛋白Fd段和κ链基因,克隆至表达载体pComb3中,并将抗体Fab段表达于噬菌体表面,建立容量为5.96×106cfu的噬菌体抗体库。以BoNTB/Hc为抗原对所建抗体库进行4轮亲和筛选,获得与B型肉毒毒素特异性结合的克隆,并进行序列测定。结果:构建了抗B型肉毒毒素Fab抗体库,筛选出特异性克隆1个。结论:从鼠源噬菌体免疫抗体库中初步获得了特异性抗B型肉毒毒素的Fab抗体。

B型肉毒毒素中毒的实验诊断及分析

目的:于2003年初,在江苏地区,因食入自制豆酱后,引起家庭内食物中毒病因的检测。方法:由临床医生依据患者的主诉和症状,初步判定为疑似食物中毒,病因不明。经过流行病学调查,收集患者进食的剩余食品,样品经过处理,进行肉毒毒素的毒力测定试验,肉毒毒素的分型试验以及肉毒梭菌的分离和培养试验。结果:测定自制豆酱中肉毒毒素含量LD50为2万单位;所检出的毒素为肉毒毒素B型。结论:综合临床诊断,流行病学调查资料和实验诊断结果,推断此次食物中毒的病因为自制豆酱中的B型肉毒毒素。

B型肉毒毒素重组Hc亚单位疫苗的免疫原性研究

目的:用大肠杆菌表达重组B型肉毒毒素受体结合区Hc抗原(BHc)作为亚单位疫苗,并研究其免疫原性。方法:构建pTIG-Trx-BHc原核表达载体,用大肠杆菌表达并纯化重组BHc抗原;免疫BALB/c小鼠以研究它的免疫原性。结果:大肠杆菌表达并纯化获得了重组BHc抗原,免疫小鼠后能刺激机体产生高效价的抗BHc抗体和保护性免疫反应。该重组BHc亚单位疫苗1μg剂量2次免疫小鼠即可产生对104LD50剂量B型肉毒毒素攻毒的完全保护,血清中和效价可达1.33 IU/m L。结论:大肠杆菌表达的重组BHc抗原具有良好的免疫原性,能够有效地保护小鼠抵抗B型肉毒毒素的攻击,该BHc抗原能够作为亚单位候选疫苗预防B型肉毒毒素中毒。

B型肉毒素干预choke Ⅱ区对大鼠跨区皮瓣的影响

目的研究B型肉毒毒素(BTX B)术中干预大鼠背部跨区穿支皮瓣choke Ⅱ区对皮瓣成活的影响。方法在大鼠背部建立三血管体穿支皮瓣模型,50只SD大鼠采用数字表法随机分为实验组(B型肉毒素组)和对照组(生理盐水组),术后即刻,对实验组皮瓣choke Ⅱ区皮下间隔0.2mm均匀注射100U,总计1500U(约0.3ml) BTX B,对照组采用相同剂量生理盐水均匀注射choke Ⅱ区。术后7天分别检测两组皮瓣的成活率;用明胶-氧化铅灌注进行皮瓣造影;取蒂部组织做HE测蒂部穿支动脉血管管径变化;取choke Ⅱ区域组织做HE测微血管数量;取choke Ⅱ区域组织做RT-PCR测VEGF、HIF-1α的表达情况。结果术后7天,实验组皮瓣的成活面积(90±2.9)%显著高于对照组(75±3.2)%,差异有统计学意义(P<0.01);明胶-氧化铅灌注造影显示实验组choke区真性吻合数较对照组明显增多。实验组choke Ⅱ区VEGF、HIF-1α基因表达均明显高于对照组(P<0.01)。实验组蒂部穿支动脉管径大于对照组(P<0.01),新生血管计数高于对照组(P<0.05)。结论 B型肉毒毒素可以促进皮瓣choke血管扩张及血管新生改善皮瓣血供,从而提高了大鼠背部跨区穿支皮瓣的成活。

B型肉毒中毒调查报告

2000年11,曹县城关镇因食用自制臭豆腐发生了一起食物中毒,经流行病学调查、临床分析和细菌学检验,确诊为B型肉毒中毒.

一起自制臭豆腐致B型肉毒中毒调查分析

河北省枣强县1990年3月发生一起食用自制臭豆腐引起食物中毒,经流行病学调查,患者临床表现,实验室诊断,证实为一起B型肉毒梭菌毒素中毒,现将调查分析报告如下: 一、流行病学调查 1、臭豆腐制作过程:2月26日,枣强县张米乡李福庄村农民张某,将购买的2.5公斤豆腐,用锅蒸后,切成小块,放入唐瓷盆内,密封后放在火炉边发酵,10天左右,加入调料,开始食用。 2、食用过程:3月8日,张某一家开始用自制臭豆腐,并将部分臭豆腐分送给其亲属及邻居,4户共13人进食,10人发病。3月12日,首例病人出现症状,以后其他,人陆续发病,3月14日最后1例患者出现症状。经调查。

一起特殊B型肉毒中毒调查

2000年4月28日至5月19日,山东菏泽市安兴、胡集、都司等3个乡镇境内8个自然村发生一起因家庭自制豆瓣酱引起的食物中毒,经流行病学调查,临床分析及实验室检查,证实为 B 型肉毒梭菌毒素所致。一、流行病学调查2000年4月13日,菏泽市安兴乡船庄村邹某某,将3公斤自产大豆炒熟,加净水浸泡24小时后。