人源化抗Cry1B毒素蛋白单链抗体的原核表达及生物学活性测定

利用含有重组噬菌粒的噬菌体直接侵染大肠杆菌(Escherichia coli)HB2151,原核分泌表达了抗苏云金芽孢杆菌(Ba-cillus thuringiensis,Bt)Cry1B毒素蛋白的单链抗体(single chain-variable fragment,scFv),经纯化、鉴定抗原结合活性后,建立了Cry1B毒素蛋白的ELISA检测方法。方法以展示scFv抗体的重组噬菌体感染E.coli HB2151,经PCR和基因测序检测克隆scFv基因片段的完整性,用SDS-PAGE方法检测scFv在E.coli HB2151宿主菌中的表达水平,用ELISA测定法检测scFv的抗原结合活性,通过时间梯度优化获得可溶性表达蛋白的最佳培养时间。结果表明:经PCR、DNA电泳及基因测序等,均证实重组噬菌体对E.coli HB2151宿主菌侵染成功,SDS-PAGE电泳结果表明scFv抗体表达成功,纯化后的蛋白质量浓度为132μg.mL-1。以纯化的scFv蛋白为基础建立了对Cry1B毒素蛋白的间接竞争ELISA法,方法的抑制中质量浓度(IC50)为1.398μg.mL-1,最低检测限(IC10)为0.025 7μg.mL-1,线性检测范围为0.5～5.0μg.mL-1,scFv对Cry1C的交叉反应率为7.51%;与Cry1Ab、Cry1Ac的交叉反应率均小于0.1%;在培养温度30℃,1 mmol.L-1IPTG诱导条件下,scFv在E.coliHB2151宿主中的最佳诱导表达时间为12 h。本研究成功地将抗Cry1B毒素蛋白的scFv在E.coli HB2151中进行了可溶性表达,获得了具有抗原结合活性的scFv融合型抗体,为实际生产应用与试剂盒研发提供了基础。

中美艰难梭菌A-B+株毒力编码区域转录及B毒素表达的研究

目的研究中国艰难梭菌A-B+型分离株BJ08和美国艰难梭菌A-B+型暴发流行株US1的毒力编码区域PaLoc各基因转录及B毒素的表达,为预防和控制中国可能暴发的艰难梭菌感染提供理论支持。方法每隔3 h提取BJ08与US1艰难梭菌和培养上清,用荧光定量聚合酶链反应(PCR)法测定各时间段两菌株毒力编码区域PaLoc各基因(tcdA、tcdB、tcdC、tcdR、tcdE)的表达;用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测BJ08和US1各时间段的细胞和培养液上清中B毒素的含量。结果 US1的生长速率稍快于BJ08,衰退速率显著快于BJ08(P<0.05);它们都不表达A毒素,但是都检测到tcdA基因的转录,而且tcdA转录没有明显差异。BJ08的tcdB、tcdC和tcdE基因的转录要比US1早3 h。B毒素在两种菌株的胞内和胞外合成或分泌没有明显差异。结论中国艰难梭菌A-B+型高分离株BJ08与美国艰难梭菌A-B+型暴发流行株US1相比,有相似的毒力表达或更强的基因调控能力,要警惕中国艰难梭菌BJ08暴发流行的可能。

G型产气荚膜梭菌NetB毒素研究进展

G型产气荚膜梭菌可引起鸡坏死性肠炎和肠毒血症,致病力强,在自然界中广泛存在,严重危害养鸡业的发展。坏死性肠炎B样毒素(necrotic enteritis B-like toxin,NetB)是近年来发现的是一种新的β-成孔毒素(β-pore-forming toxin,β-PFT),是G型产气荚膜梭菌的主要致病性毒素和保护性抗原,深入研究该毒素的结构功能及致病机理对于鸡坏死性肠炎的防控具有重要意义,但至今尚无相关系统性综述报道。鉴于此,论文主要对国内外关于G型产气荚膜梭菌的流行概况、NetB毒素的分子结构特征、生物学特性、致病机理及其相关防治制剂等方面的研究进行综述,为进一步基于NetB毒素研制鸡坏死性肠炎的防治制剂提供参考。

基于荧光生物传感技术检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素B

目的利用纳米金粒子(gold nanoparticles,AuNPs)荧光猝灭性能和核酸适配体的高亲和力,构建一种简便、灵敏的纳米金“Turn-on”型荧光生物传感方法检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxins B,SEB)的方法。方法以AuNPs作为荧光体的能量受体(猝灭剂),荧光素-单链DNA(fluorescein-ssDNA,FAM-ssDNA)作为荧光能量供体,冷冻法制备AuNPs-SEB适配体复合物,基于AuNPsSEB适配体复合物/SEB/FAM-ssDNA的竞争性结合,构建纳米金“Turn-on”型荧光生物传感检测方法。对缓冲体系pH和反应时间等条件进行优化,以牛奶为代表对方法检测性能进行验证。结果在优化好的实验条件(pH 7.5、反应时间15 min和反应温度25℃)下,在10^(-1)~10^(4)ng/mL范围内,荧光强度与SEB质量浓度之间呈现良好的线性关系,其相关系数为0.995,检出限为0.062 ng/mL。应用于牛奶样品中SEB的测定,方法回收率为91.2%~108.0%,相对标准偏差在2.6%~5.2%范围之间。结论该纳米金“Turn-on”型荧光生物传感检测技术具有简便、灵敏和准确等优点,可为食品中污染物的检测提供一种可行的新方法。

基于氧化应激和线粒体功能障碍的伏马毒素B1诱导线虫神经毒性机制

为研究线粒体功能和氧化应激在伏马毒素B1(fumonisin B1,FB1)诱导神经毒性中的作用,以秀丽隐杆线虫为模型,对FB1处理后的线虫行为表型以及包括氧化应激和线粒体功能相关指标变化进行分析。结果表明,20~200μg/mL的FB1暴露24 h以剂量依赖方式诱导细胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)相关基因(cyp35A2、sod-1、sod-3、ctl-2和ctl-3)的异常表达。此外,100~200μg/mL的FB1处理降低了线虫线粒体密度,并显著降低了三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平和线粒体膜电位(P<0.05)。200μg/mL的FB1处理显著抑制了线虫线粒体呼吸链复合物I和Ⅴ的表达,提高了线粒体分裂基因drp-1的表达水平。相关性分析显示,氧化应激和线粒体功能相关指标的表达与线虫行为学表型具有显著相关性。综上,FB1可能通过参与线虫氧化应激、线粒体呼吸链和线粒体动力学过程诱导神经毒性。

黄曲霉毒素B1诱导大鼠肝细胞凋亡率剂量效应模型的构建

通过黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)诱导大鼠肝细胞凋亡的定量数据,从而构建AFB1诱导大鼠肝细胞凋亡率的剂量效应模型。通过拟合模型获取决定系数和进一步的数学检验表明,Gamma模型(R2=0.996 4,赤池信息量准则=37.40,贝叶斯信息准则=17.19)优于其他模型。建议选用Gamma模型作为大鼠急性暴露于AFB1后肝细胞凋亡率的最优剂量效应模型,用于AFB1风险评估框架中的危害特征描述。

改性活性炭构建菌载体及其吸附玉米中黄曲霉毒素B1的工艺研究

旨在为生物处理黄曲霉毒素污染的粮食饲料提供技术支持,以活性炭(SH)为原料进行改性制备磁性活性炭(CSH),选用能高效降解黄曲霉毒素B1(AFB1)的芽孢杆菌属菌株WTX1与CSH载体共培养构建磁性菌载体(FCSH),脱除受污染玉米中的AFB1,对CSH进行BET比表面积、氮吸附-脱附等温线及其对AFB1的等温吸附曲线分析,考察FCSH构建条件和FCSH吸附条件对AFB1脱除效果的影响,并利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)和扫描电镜对吸附AFB1前后的FCSH进行表征。结果表明:CSH为大孔结构,其对AFB1的等温吸附符合Freundlich方程;在固定化时间16 h、固定化转速和吸附转速160 r/min、固定化温度和吸附温度35℃、吸附pH 8、振荡时间48 h条件下,FCSH对AFB1脱除率为97.45%;通过FTIR及扫描电镜证实了FCSH对AFB1的吸附作用,且FCSH对AFB1的吸附效果强于CSH。综上,所制备的FCSH能高效脱除玉米中的AFB1。

猪β-防御素-2在黄曲霉毒素B1致小鼠肠道炎症损伤中的作用

旨在探究猪β-防御素-2(pBD-2)在黄曲霉毒素B1(AFB1)致鼠肠道损伤中的作用。本试验以4周龄KM小鼠为研究对象,将体重相近的30只健康小鼠随机均分为5组,分别为空白对照组(不做任何处理)、DMSO组(1%DMSO灌胃)、AFB1组(0.3 mg/kg AFB1灌胃)、pBD-2组(0.03 mg/kg pBD-2灌胃)和AFB1+pBD-2组(0.3 mg/kg AFB1灌胃28 d后再用0.03 mg/kg pBD-2灌胃28 d),试验持续56 d,通过观察小鼠肠道结构的变化以及采用qPCR和免疫荧光的方法检测炎症相关因子的表达水平。结果:与对照组相比,AFB1组小鼠的平均日增重(ADG)和平均日采食量(ADFI)均呈现显著下降趋势(P<0.05),料重比(F/G)降低,但差异不显著(P>0.05),而小鼠饲喂pBD-2以后ADG和ADFI均较AFB1组显著增加(P<0.05);HE染色结果显示,AFB1导致小鼠空肠黏膜显著损伤,并伴有严重的肠壁变薄,肠绒毛萎缩、稀疏,肠绒毛高度与隐窝深度之比、相对肠绒毛数量及肠壁厚度均显著降低(P<0.05),而使用pBD-2处理小鼠损伤模型,肠道结构可见显著恢复(P<0.05);qPCR和免疫荧光染色结果表明,AFB1处理小鼠可显著上调白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05),但对白细胞介素-8(IL-8)的表达水平出现了下调趋势,而用pBD-2处理小鼠损伤模型后可显著下调炎症因子的表达水平,说明pBD-2对AFB1造成的肠黏膜炎症具有缓解作用。本研究结果为AFB1中毒的防控及pBD-2在畜牧生产中的应用提供了科学依据。

量子点荧光微球免疫法定量检测小麦中黄曲霉毒素B1

目的建立量子点荧光微球免疫法快速检测小麦中黄曲霉毒素B1的方法。方法采用量子点荧光微球作为荧光标记物,与黄曲霉毒素B1的单克隆抗体偶联,构建量子点荧光微球探针。优化缓冲液pH、抗体最小标记量、荧光探针用量和包被抗原浓度等实验条件,建立检测卡上T线和C线信号峰值面积的比值与样本中黄曲霉毒素B1浓度的关系,构建定量标准曲线。针对小麦样品,将该检测方法与时间分辨荧光定量检测方法进行比较。结果本研究建立的荧光定量免疫层析检测方法最佳反应条件为:pH 7.5磷酸钠缓冲液,抗体标记量为20μg,荧光探针用量为4.0μL,抗原质量浓度使用0.40mg/mL。小麦中黄曲霉毒素B1的定量检测线性范围为0.05~25.00μg/kg,相关系数(r^(2))为0.9994,检出限为0.02μg/kg,定量限为0.05μg/kg。加标回收率为91.50%~115.00%,变异系数为1.88%~5.46%。结论本研究建立的荧光定量免疫层析方法快速、准确、稳定性好、可靠性高,适用于小麦中黄曲霉毒素B1的现场快速检测。

基于纳米抗体-荧光素酶的黄曲霉毒素B1检测方法构建

黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种剧毒、致癌的食源性污染物,严重威胁食品安全和公共健康。为开发快速检测AFB1的生物发光酶联免疫分析(BLEIA)方法,系统测试了3种抗AFB1特异性纳米抗体(NB)与纳米荧光素酶(Nluc)融合蛋白(G8-Nluc、Nluc-NB26和Nluc-NB28)的可溶性表达、纯化情况及酶催化活性。基于3种融合蛋白分别建立BLEIA检测体系,选择Nluc-NB26用于谷物样品的分析和验证。结果表明,Nluc-NB26的可溶性表达量最高,稳定性更好,Nluc-NB28的可溶性表达量次之,而G8-Nluc基本不可溶。不同表面活性剂对G8-Nluc的促溶解性研究表明,添加N-月桂酰肌氨酸钠可显著提高其溶解度,纯化得到的3种融合蛋白均具有良好的酶活性及抗原结合活性。基于融合蛋白的BLEIA检测结果显示,Nluc-NB28-BLEIA、G8-Nluc-BLEIA和Nluc-NB26-BLEIA体系检测AFB1的IC_(50)值分别为4.213,1.697,2.169 ng/mL,表明G8-Nluc-BLEIA体系的灵敏度最高,Nluc-NB26-BLEIA与前者接近,Nluc-NB28-BLEIA最低。综合考虑融合蛋白的可溶性表达量、稳定性及检测性能,对Nluc-NB26-BLEIA开展实际样品的分析和验证,结果表明:这一方法检测谷物中AFB1的平均回收率在91.1%~104.1%之间,与商业化酶联免疫吸附测定试剂盒结果相似,而检测的时间和试剂成本明显降低。研究结果为开发快速、高灵敏的AFB1检测技术提供参考。

射频联合热风加热对玉米籽粒中黄曲霉毒素B1降解及玉米品质的影响

为研究射频-热风联合处理玉米中的黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)降解效果,分析不同初始水分质量分数(19.05%、22.25%、25.55%)、射频加热温度(55、65、75、85℃)和加热持续时间(10、15、20、25 min)对玉米籽粒中AFB1降解效果及玉米品质的影响。结果表明:射频-热风联合处理可有效降解AFB1,在高水分含量下,加热温度和时间一定,初始水分含量越高,AFB1残留量越高;初始水分含量一定,随温度增加和时间延长,AFB1残留量随之减少,且加热持续时间对降解效果的影响大于加热温度;射频-热风联合处理玉米籽粒过程中,对其品质有一定影响,随温度升高和时间延长,与对照组相比,蛋白质、脂肪含量无显著差异(P>0.05),黏度系数显著降低(P<0.05);低场核磁共振分析表明,射频加热过程中水分迁移效果明显,且水分迁移特性与玉米的糊化特性、蛋白质、脂肪含量显著相关(P<0.05)。

鸡骨草黄酮对黄曲霉毒素B_(1)诱导雏鸡肝损伤的缓解作用

研究旨在探讨鸡骨草黄酮(ACE)能否减轻黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))诱导的肝毒性作用,为临床防治AFB_(1)引起的肝损伤提供新思路。选择健康三黄鸡60羽,随机分为3组,每组4个重复,每个重复5只鸡。空白对照组(NC组)饲喂基础日粮,AFB_(1)组饲喂基础日粮+2.8 mg/kg AFB_(1),ACE组饲喂基础日粮+2.8 mg/kg AFB_(1)+1 g/kg ACE。试验期7 d。结果显示,与NC组相比,AFB_(1)组雏鸡14日龄体重、肝脏谷胱甘肽转移酶(GST)表达量以及肝脏过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著降低(P<0.05),雏鸡血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)和γ-谷氨酰转肽酶(GGT)活性及肝脏丙二醛(MDA)含量、肝脏细胞色素P450酶1A2 (CYP1A2)表达量显著升高(P<0.05)。与AFB_(1)组相比,ACE组雏鸡14日龄体重、肝脏GST表达量以及CAT、SOD、GSH-Px活性显著升高(P<0.05),雏鸡血清AST、ALT、ALP和GGT活性及肝脏MDA含量、肝脏CYP1A2表达量显著下降(P<0.05)。研究表明,日粮补充ACE可能通过增强抗氧化能力和抑制关键的细胞色素P450酶(CYP450)同工酶介导的AFB1对有毒产物AFB1-8,9-环氧化物(AFBO)的激活,起到协同作用,从而保护雏鸡免受AFB1诱导的肝损伤。

艰难梭菌毒素B2型蛋白重组表达及活性分析

目的 构建艰难梭菌高毒力株2型毒素B(TcdB2)的枯草芽胞杆菌工程株,获得高效表达的生物活性TcdB2蛋白。方法 以ST1/RT027型菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得TcdB2全长基因片段,构建到PHT01载体中,转化枯草芽胞杆菌WB800N菌株,进行原核表达获得TcdB2全长蛋白,进一步通过细胞毒性试验验证重组TcdB2的生物活性。结果 成功构建了高效表达TcdB2的枯草芽胞杆菌工程株,并获得具有细胞毒性的重组蛋白TcdB2。结论 具有生物活性的重组TcdB2蛋白,为进一步研究艰难梭菌高毒力株的致病机制和作为疫苗候选靶标等奠定了基础。

乳酸菌肽聚糖对雏鸭饲粮中黄曲霉毒素B 1的脱毒效果研究

本试验旨在探究乳酸菌肽聚糖对黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))的吸附作用,为乳酸菌肽聚糖的制备和饲粮中AFB_(1)的脱毒提供科学依据及理论基础。试验以4种乳酸菌(嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌)为原料提取乳酸菌肽聚糖,采用高效液相色谱法比较4种乳酸菌肽聚糖对AFB_(1)的体外吸附率,选取体外吸附效果最好的罗伊氏乳杆菌肽聚糖进行动物试验。选择1日龄健康樱桃谷鸭120只,随机分为5组,每组4个重复,每个重复6只。对照组饲喂基础饲粮,AFB_(1)组在基础饲粮中添加0.10 mg/kg AFB_(1),试验组在AFB_(1)组饲粮中分别添加0.10%(Ⅰ组)、0.15%(Ⅱ组)和0.20%(Ⅲ组)罗伊氏乳杆菌肽聚糖。预试期3 d,正试期21 d。结果表明:1)乳酸菌肽聚糖种类、添加量及二者的交互作用均能够显著影响AFB_(1)的体外吸附率(P<0.05),其中10.0 mg/mL罗伊氏乳杆菌肽聚糖对AFB_(1)的体外吸附率最高,达75.29%。2)与对照组相比,AFB_(1)组的平均日增重、平均日采食量显著降低(P<0.05),料重比显著升高(P<0.05);血浆谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)活性及丙二醛(MDA)含量显著升高(P<0.05),肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊指数显著升高(P<0.05),血浆免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及总抗氧化能力(T-AOC)显著降低(P<0.05)。3)与AFB_(1)组相比,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的平均日增重显著升高(P<0.05),料重比显著降低(P<0.05);Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的血浆IgG、IFN-γ、IL-2、IL-4含量和SOD、GSH-Px活性显著升高(P<0.05),血浆AST、AKP、ALT活性及MDA含量显著降低(P<0.05);Ⅱ、Ⅲ组的胸腺和法氏囊指数显著降低(P<0.05)。由此可见,不同乳酸菌肽聚糖对AFB_(1)体外吸附效果不同,饲粮中添加罗伊氏乳杆菌肽聚糖能够部分消除AFB_(1)对雏鸭造成的生长性能下降,改善AFB_(1)所导致的免疫功能降低以及肝脏毒性。

基于全合成纳米抗体库的黄曲霉毒素B1抗体制备

目的利用全合成纳米抗体库筛选制备黄曲霉毒素B1(aflatoxinB1,AFB1)的纳米抗体。方法制备AFB1完全抗原并依托全合成纳米抗体库进行4轮筛选,将捕获的高亲和力抗体基因转化至原核表达系统表达,分析纯化后的抗体特异性及亲和力,并构建抗体G5-AFB1复合三维结构,分析二者的结合特点。结果在AFB1完全抗原制备基础上筛选,随着轮数的增加,特异性噬菌体明显富集,最终获得一株阳性单克隆G5,经鉴定,其半数效应浓度(effec-tive concentration 50%,EC50)为0.953μmol/L,半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)为43μmol/L。另外,G5-AFB1复合物不仅形成了稳定的氢键,也具备较好的疏水和静电作用。结论通过全合成纳米抗体库可以筛选出良好的AFB1抗体,为AFB1检测与治疗提供了良好基础,也证实了噬菌体展示技术以及全合成纳米抗体库在小分子生物毒素抗体制备中具有较大的发展潜力。

大曲中黄曲霉毒素B1的高效液相色谱检测方法

建立一种利用高效液相色谱检测酿酒大曲中黄曲霉毒素B1的方法。通过对前处理过程的溶剂选择、提取溶剂浓度、提取时间、免疫亲和柱前溶剂浓度的实验,采用单因素分析、正交实验设计找出最佳前处理条件,再通过线性范围、重复性、加标回收率对方法进行评价。此方法检测灵敏度高、重复性好,各类大曲的加标回收率都在85%~95%,结果可靠,适合各酿酒企业对大曲中黄曲霉毒素B1的内部风险控制。

复杂食品基质中黄曲霉毒素B1测定方法改进优化

改进GB 5009.22-2016《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》中高效液相色谱法测定复杂食品基质(花椒、胡椒和辣椒等)中的黄曲霉毒素B1的方法,将提取时甲醇–水溶液(70:30)用量提高至30 mL,上样液混匀后重复高速离心一次,上样液滴完后加入5 mL PBS缓冲液淋洗免疫亲和柱,色谱条件改为梯度洗脱,分别提高色谱柱温度和衍生反应管温度为44℃和80℃,该优化方法较好地减少了样品中黄曲霉毒素B1的损失,净化过程更简单、快速,能大幅减少高效液相色谱分析时间,回收率和精密度更满意,适用于花椒、胡椒和辣椒类样品中黄曲霉毒素B1的检测分析。

HPLC-柱后光化学衍生法测定玉米中黄曲霉毒素B1的不确定度评定

本文采用HPLC-柱后光化学衍生法测定玉米中黄曲霉毒素B1含量,通过系统分析整个测定过程的影响因素,评估不确定度来源,评定各个不确定度分量,发现标准物质浓度、标准溶液配制与测量重复性引入的不确定度对测量结果的影响较大。当玉米样品中黄曲霉毒素B1含量为7.86μg·kg^(-1)时,扩展不确定度为0.68μg·kg^(-1)(k=2)。

坚果类农产品样品状态与保存条件对黄曲霉毒素B1检测结果影响的研究

本研究通过培养坚果类阳性样品,在不同温度、不同颗粒状态、不同保存时间下进行取样检测,旨在评估样品保存温度、保存时间以及样品状态对黄曲霉毒素B1检测结果的影响。结果表明,阳性样品在30℃条件下,黄曲霉毒素B1含量明显增加,在0~4℃和-18℃保存条件下,阳性样品的检测浓度基本不变;样品颗粒状态对检测结果影响较大,粉碎后的样品中黄曲霉毒素B1的含量增加更明显。

高效液相色谱法测定食用植物油中黄曲霉毒素B1的要点与步骤

由于生产、储存和加工过程中的各种因素,植物油中往往存在着一些有害物质,其中包括黄曲霉毒素B1(简称AFB1)。AFB1是一种致癌物质,长期摄入可能导致肝癌等严重疾病。基于此,本文简单讨论测定食用植物油中AFB1的意义,深入探讨高效液相色谱法测定食用植物油中AFB1的要点与步骤,以供参考。