电针对继发性脊髓损伤后大鼠神经元自噬及相关蛋白轻链3Ⅱ和bcl-2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白3表达的影响

目的观察电针治疗对大鼠继发性脊髓损伤(SCI)后神经元自噬及相关蛋白表达的影响。方法健康SD大鼠随机分为对照组、模型组、西药组(甲泼尼龙治疗)及电针组(电针大椎、命门穴治疗)4组;除对照组外,其他3组均采用改良的Allen打击装置(50 g/cm)复制大鼠T10~11中度SCI模型。分别于SCI后6 h、1 d、7 d取损伤局部脊髓组织,经透射电子显微镜及Western印迹法,观察各组SCI后神经元自噬的病理变化及轻链(LC)3Ⅱ、bcl-2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白(BNIP)3的表达。结果 1SCI后1 d脊髓组织中LC3Ⅱ、BNIP3表达明显升高(P<0.01);电针组和西药组SCI后脊髓组织中LC3Ⅱ、BNIP3的表达显著降低,与模型组差异显著(P<0.01);西药组与电针组差异不显著(P>0.05)。2在透射电镜观察下,对照组脊髓组织神经元细胞核膜完整,胞质中线粒体形态分布及数目正常,未发现自噬小体,溶酶体数目也未见增多;模型组脊髓组织可见线粒体肿胀明显、空泡化,溶酶体数量增多,细胞核形不规则,可发现自噬小体;西药组和电针组可见脊髓组织神经元细胞肿胀,线粒体也略肿胀,核形规则,核内染色质欠均匀,溶酶体数目未见明显增多。结论电针可降低SCI大鼠脊髓组织中LC3Ⅱ和BNIP3的表达,抑制细胞自噬,减缓脊髓损伤后的病理损害,其作用与甲泼尼龙相仿。

低氧条件下B淋巴细胞瘤-2/腺病毒E1B19 000相互作用蛋白3对人真皮微血管内皮细胞迁移和运动性的影响及其机制

目的探讨低氧条件下B淋巴细胞瘤-2/腺病毒E1B 19000相互作用蛋白3(BNIP3)对人真皮微血管内皮细胞(HDMEC)迁移和运动性的影响及其机制。方法采用实验研究方法。(1)取HDMEC,采用随机数字表法(下同)分成行常规培养的常氧组及采用体积分数2%氧气低氧处理相应时间点的低氧6、12、24 h组,采用蛋白质印迹法检测细胞中BNIP3及微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)的蛋白表达。(2)取HDMEC,分成常氧+空载组、常氧+BNIP3敲减组、低氧+空载组、低氧+BNIP3敲减组,分别转染空载病毒或BNIP3敲减病毒并进行常氧或低氧处理6 h,采用蛋白质印迹法和免疫荧光染色法检测BNIP3的蛋白表达;采用划痕试验检测划痕后24 h的划痕面积,并计算划痕愈合率;在活细胞工作站测算3 h内细胞运动的曲线距离,计算运动速度。(3)取HDMEC,同实验(2)分组及处理,采用蛋白质印迹法和免疫荧光染色法检测LC3Ⅱ的蛋白表达。以上实验样本数均为3。对数据行单因素方差分析及LSD检验。结果(1)与常氧组比较,低氧6、12、24 h组细胞BNIP3及LC3Ⅱ的蛋白表达量显著增加(P<0.01)。(2)培养6 h,与低氧+空载组比较,常氧+空载组和低氧+BNIP3敲减组细胞BNIP3的蛋白表达量显著下降(P<0.05或P<0.01)。常氧+空载组和常氧+BNIP3敲减组细胞中表示BNIP3蛋白表达的红色荧光较弱,低氧+空载组细胞红色荧光较强,低氧+BNIP3敲减组细胞中红色荧光较低氧+空载组明显减弱。划痕后24 h,低氧+空载组细胞划痕基本愈合,其他3组细胞剩余划痕面积较大。常氧+空载组、常氧+BNIP3敲减组、低氧+空载组、低氧+BNIP3敲减组细胞划痕愈合率分别为(61±4)%、(58±4)%、(88±4)%、(57±4)%。低氧+空载组细胞划痕愈合率明显高于常氧+空载组(P<0.01)和低氧+BNIP3敲减组(P<0.05)。观察3 h内,低氧+空载组细胞运动范围较常氧+空载组显著增大,低氧+BNIP3敲减组细胞运动范围较低氧+空载组明显缩小;低氧+空载组细胞曲线运动速度较常氧+空载组和低氧+BNIP3敲减组明显增加(P<0.01)。(3)培养6 h,与低氧+空载组比较,常氧+空载组和低氧+BNIP3敲减组细胞LC3Ⅱ的蛋白表达量显著下降(P<0.05或P<0.01)。培养6 h,常氧+空载组和常氧+BNIP3敲减组细胞中表示LC3蛋白表达的红色荧光较弱,低氧+空载组细胞红色荧光明显增强,低氧+BNIP3敲减组细胞红色荧光被显著抑制。结论低氧条件下BNIP3可促进HDMEC的迁移和运动性,且自噬可能参与BNIP3对HDMEC迁移和运动性的调节。

DNA甲基化和缺氧对食管癌细胞中B细胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白3基因表达的影响

目的 观察DNA甲基化及缺氧与沉默缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）对食管癌细胞中B细胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）/腺病毒E1B 19 000相互作用蛋白3（BNIP3）基因表达的影响.方法 收集食管癌细胞株KE4、Kyse-140、Caes-17和TE-7,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别检测BNIP3 mRNA和蛋白表达水平,甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测BNIP3启动子区甲基化状态.MIC-101乏氧培养系统模拟肿瘤缺氧微环境,实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）和Western blot检测缺氧（1％O2）、常氧及小干扰RNA（siRNA）沉默HIF-1α后Caes-17细胞中BNIP3mRNA和蛋白表达水平.结果 BNIP3在KE4和Caes-17细胞中表达水平均较高,而在TE-7和Kyse-140细胞中表达较低;同时MSP结果显示,在TE-7和Kyse-140细胞中BNIP3启动子区发生了明显的甲基化,经5-氮杂-2＇-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）处理2个细胞株后,BNIP3启动子区甲基化状态得到了逆转,同时其表达水平显著升高.缺氧条件下,Caes-17细胞中BNIP3 mRNA （4.35±0.20）和蛋白（1.23±0.04）的表达水平较常氧时（BNIP3 mRNA：1.07 ±0.12,BNIP3蛋白：0.28 ±0.03）显著升高（P＜0.05）,siRNA转染Caes-17细胞后能显著下调HIF-1α的表达（抑制率为90％）,并导致BNIP3基因的表达（BNIP3 mRNA：1.12 ±0.14,BNIP3蛋白：0.34±0.03）受到明显的抑制.结论 BNIP3基因启动子区甲基化是导致其在食管癌细胞中表达较弱的重要原因之一,甲基化酶抑制剂可逆转BNIP3的甲基化状态重新恢复其表达;缺氧能使HIF-1α蛋白的表达升高,同时上调BNIP3的表达水平.

B淋巴细胞瘤-2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3介导的线粒体自噬机制及其调控肌源性挛缩发生的研究进展

线粒体自噬是一种自噬的形式,是目前已知的选择性清除线粒体的途径。近年来,B淋巴细胞瘤-2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3(BNIP3)因其在线粒体自噬中的潜在作用而备受关注。尽管对BNIP3在线粒体自噬中的调控机制认识不断增加,但在肌源性挛缩的发生过程中,BNIP3介导的线粒体自噬的作用及其机制仍知之甚少。在肌源性挛缩发生过程中,典型的病理特征表现为骨骼肌萎缩和纤维化。因此,本文对BNIP3及其在线粒体自噬中的调控机制进行了系统回顾,并对BNIP3介导的线粒体自噬影响骨骼肌萎缩和纤维化的研究进行了综述,以期为肌源性挛缩的治疗提供新的思路。

三七总皂苷预处理通过激活HIF-1α/BNIP3线粒体自噬信号通路减少心肌细胞H/R损伤的机制研究

目的探索三七总皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)预处理心肌细胞减少缺氧/复氧(hypoxiareoxygenation,H/R)损伤的作用机制。方法设置对照组(常规培养H9c2细胞)、模型组(H/R损伤的H9c2细胞)、PNS组(加入PNS处理的H/R损伤的H9c2细胞)、二甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,2-ME2)组(加入2-ME2处理的H/R损伤的H9c2细胞)和PNS+2-ME2组心肌细胞(同时加入PNS和2-ME2处理的H/R损伤的H9c2细胞),采用酶联免疫吸附法检测心肌细胞损伤,蛋白质印迹法检测线粒体自噬信号通路表达,免疫荧光法检测心肌细胞自噬活性。结果模型组高于对照组的指标有肌酸激酶(creatine kinase,CK)(0.37±0.05 vs.2.41±0.66)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)(2.20±0.69 vs.4.05±1.08)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate amino transferase,AST)(38.17±9.02 vs.107.83±20.89)、细胞自噬标志物LC3(0.17±0.05 vs.0.63±0.66)、低氧诱导因子-1α(hypoxic inducible factor-1α,HIF-1α)(0.22±0.09 vs.0.66±0.08)和B淋巴细胞瘤-2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3(B lymphocytoma-2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3,BNIP3)(0.15±0.02 vs.0.59±0.13),差异均有统计学意义(P<0.05)。PNS组低于模型组的指标有CK(2.41±0.66 vs.1.55±0.39)、LDH(4.05±1.08 vs.3.19±0.88)、AST(107.83±20.89 vs.66.52±11.43),差异均有统计学意义(P<0.05);PNS组高于模型组的指标有LC3(0.63±0.66 vs.0.85±0.23)、HIF-1α(0.66±0.08 vs.0.91±0.22)和BNIP3(0.59±0.13 vs.0.82±0.17),差异均有统计学意义(P<0.05)。2-ME2+PNS组低于模型组的指标有CK(2.41±0.66 vs.2.08±0.54)、LDH(4.05±1.08 vs.3.51±0.92)、AST(107.83±20.89 vs.83.49±19.53);2-ME2+PNS组高于模型组的指标有LC3(0.63±0.66 vs.0.70±0.54)、HIF-1α(0.66±0.08 vs.0.72±0.10)和BNIP3(0.59±0.13 vs.0.64±0.12),差异均有统计学意义(P<0.05)。2-ME2组高于模型组的指标有CK(2.41±0.66 vs.3.62±0.98)、LDH(4.05±1.08 vs.5.67±1.39)、AST(107.83±20.89 vs.192.13±28.97),差异均有统计学意义(P<0.05);2-ME2组低于模型组的指标有HIF-1α(0.66±0.08 vs.0.27±0.03)和BNIP3(0.59±0.13 vs.0.25±0.07),差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,模型组心肌细胞LC3荧光斑点数明显增加(P<0.05);与模型组相比,PNS组和2-ME2+PNS组心肌细胞LC3荧光斑点数明显增加,2-ME2组LC3荧光斑点数明显减少(P<0.05)。结论PNS能够通过激活HIF-1α/BNIP3线粒体自噬信号通路,减少心肌细胞H/R损伤。

青光安Ⅱ号方对诱导损伤的RGC-5细胞中NF-κB/HIF-1α通路相关细胞因子的影响

目的观察青光安Ⅱ号方对谷氨酸诱导损伤的RGC-5细胞中核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)、BCL2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3,BNIP3)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)的影响。方法体外培养RGC-5细胞,分为4组:空白组、模型组、含药血清组和阻断剂组。模型组、含药血清组和阻断剂组予以谷氨酸诱导细胞损伤,模拟青光眼对神经节细胞的损伤,含药血清组加入青光安Ⅱ号方含药血清,阻断剂组加入KC7F2进行HIF-1α通路的阻断。以CCK-8法摸索含药血浆以及谷氨酸的最佳干预浓度;采用Hoechst法检测各组细胞的凋亡情况;Western blot检测NF-κB、HIF-1α、BNIP3蛋白表达情况;比色法检测SOD、MDA的表达情况。结果CCK8法确定青光安Ⅱ号方5倍组含药血清为实验量,确定谷氨酸的最佳干预浓度为200μM。与空白组比较,模型组NF-κB、HIF-1α、BNIP3、SOD、MDA表达显著升高(P<0.05);与模型组比较,含药血清组、阻断剂组NF-κB、HIF-1α、BNIP3和SOD的表达显著降低(P<0.05);含药血清组与阻断剂组的NF-κB、HIF-1α、BNIP3、SOD及MDA差异均无统计学意义(P>0.05)。结论青光安Ⅱ号方对NF-κB具有抑制作用,进而抑制了HIF-1α相关通路的激活,减弱了由于氧化应激所致RGC-5细胞的凋亡,对RGC具有保护作用。

益气养阴化浊通络方对高糖诱导小鼠肾足细胞自噬ATG5、Beclin-1及BNIP3表达的影响

目的:观察益气养阴化浊通络方对高糖诱导的小鼠肾足细胞自噬相关蛋白5(autophagy-related protein 5,ATG5)、B细胞淋巴瘤-2蛋白相互作用中心卷曲螺旋蛋白1(B-cell lymphoma-2-interacting myosin-like coiled-coil protein 1,Beclin-1)及B淋巴细胞瘤-2基因/腺病毒E1B相互作用蛋白3(B-cell lymphoma-2/adenovirus E1 B interacting protein 3,BNIP3)表达的影响,探讨其对自噬的作用。方法:选取Wistar大鼠,分别灌胃20,40,80 g·kg^(-1)益气养阴化浊通络方及生理盐水,制备低、中、高浓度含药血清和空白血清。体外培养小鼠肾足细胞,分为正常对照组、高糖组、益气养阴化浊通络方低、中、高剂量组和雷帕霉素组。CCK-8法检测细胞增殖,细胞划痕检测细胞迁移能力,qRT-PCR和Western blot检测微管相关蛋白1轻链3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3 B,LC3B)、ATG5、Beclin-1及BNIP3 mRNA和蛋白表达。结果:与空白对照组相比,高糖组足细胞增殖减弱,迁移能力增强,LC3B、ATG5、Beclin-1及BNIP3 mRNA和蛋白表达显著减弱;与HG组相比,益气养阴化浊通络方低、中、高剂量含药血清组及雷帕霉素组均可促进足细胞增殖,抑制足细胞迁移,明显促进LC3B、ATG5、Beclin-1及BNIP3 mRNA和蛋白表达。结论:益气养阴化浊通络方能够促进高糖诱导的小鼠肾足细胞自噬,调节足细胞增殖及迁移。

5-氮杂脱氧胞苷对胶质母细胞瘤细胞U87增殖的影响及其机制探讨

目的观察5-氮杂脱氧胞苷对胶质母细胞瘤细胞U87增殖的影响,并探讨其可能机制。方法采用不同浓度(0、0.1、0.5、1.0、5、10μmol/L)5-氮杂脱氧胞苷作用于U87细胞,比较细胞增殖抑制率和Bcl-2腺病毒E1B19k Da相关蛋白3 mRNA(BNIP3 mRNA);将5μmol/L的5-氮杂脱氧胞苷作用于U87细胞0、1、2、3、4、5、6 d,比较细胞增殖抑制率及BNIP3 mRNA。将5μmol/L 5-氮杂脱氧胞苷作用于U87细胞4 d,并分别添加和不添加Caspase抑制剂Boc-D-FMK,测算细胞增殖抑制率。结果 5-氮杂脱氧胞苷对U87细胞增殖有抑制作用,且呈剂量及时间依赖性(P均<0.05),抑制作用最强的浓度为5μmol/L,最强的时间点为4 d;Boc-D-FMK并不能抑制由BNIP3所诱导的细胞凋亡,P>0.05。结论 5-氮杂脱氧胞苷可抑制U87细胞增殖,其机制可能与BNIP3 mRNA表达上调有关。

骨形态发生蛋白-7对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的:探讨骨形态发生蛋白-7(130ne morphogenetic protein-7,BMP-7)对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其可能的作用机制。方法:采用线栓法建立大脑局灶性脑缺血再罐注损伤模型,按照随机数字表法将Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、BMP-7治疗组。在缺血2 h再灌注24 h后对各组进行神经功能评分。采用原位末端标记法(TUNEL法)检测皮质区神经细胞凋亡,采用实时定量-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western b10tting)分别检测皮层区凋亡活化因子-1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)和Bcl-2/腺病毒E1 B 1 9kDa相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3,BNIP3)的mRNA及蛋白的表达。结果:与模型组相比,BMP-7治疗组大鼠神经功能评分明显降低,TUNEL阳性细胞数减少,缺血侧皮层Apaf-1和BNIP3的mRNA和蛋白表达均降低。结论:BMP-7可能通过下调Apaf-1和BNIP3的表达抑制神经细胞凋亡,从而减轻脑缺血再灌注损伤。

microRNA-182-5p靶向BNIP3抑制卵巢癌细胞增殖和迁移的研究

目的探讨microRNA-182-5p(miR-182-5p)对卵巢癌SKOV3细胞增殖和迁移的抑制作用及其作用机制。方法将对数生长期SKOV3细胞随机分为空白组、对照组和实验组,并分别转染空白试剂、miR-182-5p拟似物、miR-182-5p+LV-BNIP3。转染后24 h,用噻唑蓝法检测细胞的增殖活性,用逆转录聚合酶链反应法检测miR-182-5p的表达水平,用Western Blotting法检测BNIP3蛋白的表达水平,用Transwell小室法检测细胞的迁移能力。结果转染后24 h,实验组、对照组和空白组的增殖活性(OD值)分别为(0.38±0.04),(0.17±0.03)和(0.39±0.02),miR-182-5p表达水平分别为(2.55±0.11),(2.52±0.13)和(0.98±0.11),BNIP3蛋白表达水平分别为(0.99±0.12),(0.42±0.11)和(0.96±0.09),穿膜细胞数分别为(138±29),(64±18)和(132±23)个,对照组的上述指标与实验组和空白组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论过表达miR-182-5p对卵巢癌SKOV3细胞具有抑制作用,BNIP3可能是miR-182-5p调节卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移的作用靶点。

HIF-1α/BNIP3信号通路对BCG诱导巨噬细胞自噬的影响

【背景】缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF-1α)是响应细胞低氧反应的关键因子,在红细胞生成、血管形成、能量代谢及调节宿主免疫代谢中发挥着重要作用。【目的】探讨HIF-1α/Bcl-2-腺病毒E1B相互作用蛋白3(Bcl-2-adenovirus E1B 19-kDa interacting protein 3,BNIP3)信号通路对牛分枝杆菌卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7自噬的影响。【方法】构建HIF-1α的小干扰RNA(siHIF-1α),转染RAW 264.7细胞后,结合BCG感染,采用流式细胞仪检测细胞自噬率,用Western blotting或免疫荧光技术检测HIF-1α、BNIP3、LC3、Beclin 1、Rheb和mTOR的表达水平。【结果】BCG感染显著上调巨噬细胞中LC3和HIF-1α的表达,用siHIF-1α结合BCG感染后显著下调巨噬细胞中HIF-1α、BNIP3、LC3、Beclin 1和细胞自噬率水平,并促进Rheb和p-mTOR的表达。【结论】在BCG感染RAW 264.7细胞过程中,干扰HIF-1α表达抑制了HIF-1α/BNIP3信号通路,进而激活了mTOR途径,抑制BCG感染诱导的细胞自噬。

UVB诱导A375细胞自噬与凋亡调控机制探讨

目的探究中波紫外线(UVB)对人表皮黑色素瘤细胞株A375细胞自噬与凋亡的诱导效应。方法 (1)取对数生长期A375细胞,分别予剂量为10.0、15.0 m J/cm^2的UVB照射,于照射后3、6、9、12 h收集细胞,用单丹磺酰戊二胺染色法观察细胞自噬,用吖啶橙/溴乙锭染色法观察细胞凋亡。(2)予相应剂量的UVB照射10.0、15.0 m J/cm^2组A375细胞,于照射后18、24、36、48 h收集细胞,以CCK-8法检测细胞存活率。(3)予剂量为10.0、15.0 m J/cm^2的UVB照射A375细胞,于照射后3、6、9、12 h收集细胞;予剂量为2.5、5.0、7.5、10.0、15.0 m J/cm^2的UVB照射A375细胞,于照射后9 h收集细胞;用免疫印迹法检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Bcl-2相互作用蛋白(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ的表达。上述3个实验均另设不予UVB照射(予假照射)的对照组。结果 (1)剂量为10.0、15.0 m J/cm^2的UVB照射诱导的A375细胞自噬和细胞凋亡均表现为随着照射后时间的延长而增强,但在15.0 m J/cm^2UVB照射后12 h,细胞自噬已观察到降低。(2)10.0、15.0 m J/cm^2组细胞活力均随照射后时间的推移而增加(P<0.05);在照射后18~48 h,10.0和15.0 m J/cm^2组细胞活力均低于对照组(P<0.05);在照射后24~48 h,15.0 m J/cm^2组细胞活力均低于10.0 m J/cm^2组(P<0.05)。(3)10.0 m J/cm^2组细胞Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白相对表达水平在照射后0~12 h内均随照射时间的增加而增加(P<0.05),而15.0 m J/cm^2组细胞仅在照射后0~9 h内观察到上述改变,在12 h时间点上述2个自噬相关蛋白明显下降(P<0.05);10.0和15.0 m J/cm^2组细胞Bcl-2蛋白相对表达水平在照射后3~12 h内均随照射时间的增加而下降(P<0.05),Bax蛋白相对表达水平均在照射后0~12 h内随照射时间的增加而增加(P<0.05)。0.0~10.0 m J/cm^2组细胞Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白相对表达水平,0.0~15.0 m J/cm^2组细胞Bax蛋白相对表达水平,均随照射剂量的增加而增加(P<0.05);5.0~15.0 m J/cm^2组Bcl-2蛋白相对表达水平随照射剂量的增加而下降(P<0.05)。结论剂量为10.0和15.0 m J/cm^2UVB照射均可诱导A375细胞发生自噬和凋亡;10.0 m J/cm^2UVB照射诱导的细胞自噬可部分抵抗UVB对凋亡的诱导而使细胞活力增强,15.0 m J/cm^2UVB诱导的自噬不足以发挥上述作用,且以诱导凋亡为主导效应。

大黄黄连泻心汤加味对肥胖2型糖尿病大鼠内脏脂肪线粒体自噬及棕色化影响

目的:观察大黄黄连泻心汤加味对肥胖2型糖尿病(T2DM)模型ZDF大鼠内脏脂肪组织线粒体自噬及棕色化的影响。方法:将40只ZDF大鼠高脂饲料诱导为肥胖T2DM模型,随机分为模型组、二甲双胍组(0.18 g·kg^(-1))、大黄黄连泻心汤加味高、中、低剂量组(2.16、1.08、0.54 g·kg^(-1)),每组8只,另取8只ZDF(fa/+)大鼠作为正常组,灌胃体积均为10 mL·kg^(-1),模型组和正常组灌服等体积纯净水,1次/d,持续12周。定期检测大鼠空腹血糖(FBG);干预12周后检测大鼠体质量、附睾脂肪质量、血清中葡萄糖(GLU)、糖化血清蛋白(GSP)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平;采用苏木素-伊红(HE)染色观察附睾脂肪组织病理形态学改变;透射电镜(TEM)观察脂肪细胞线粒体自噬情况;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测附睾脂肪低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、腺病毒E1B19kD相互作用蛋白3(BNIP3)、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、泛素结合蛋白1(p62)、解偶联蛋白1(UCP1)、碘代甲状腺素2(Dio2)、PR结构域结合因子16(Prdm16)mRNA表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测附睾脂肪HIF-1α、BNIP3、LC3B、p62及UCP1蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠附睾脂肪出现病理学改变;脂肪细胞线粒体固缩、自噬小体较多并发生线粒体自噬;大鼠体质量、附睾脂肪质量、FBG、GLU、GSP、TC、TG、LDL-C水平显著升高(P<0.01),HDL-C水平显著降低(P<0.01),附睾脂肪HIF-1α、BNIP3、LC3B mRNA及蛋白表达显著升高(P<0.01),p62、UCP1 mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.01),Dio2、Prdm16 mRNA表达显著降低(P<0.01)。与模型组比较,各给药组大鼠附睾脂肪组织病变不同程度减轻;二甲双胍组和大黄黄连泻心汤加味高剂量组大鼠脂肪细胞胞浆中线粒体形态结构完整,嵴清晰,基质均匀,胞浆中可见少量自噬溶酶体和自噬小体;二甲双胍组、大黄黄连泻心汤加味高、中剂量组大鼠体质量及附睾脂肪质量均显著降低(P<0.01);各给药组大鼠附睾脂肪指数均明显降低(P<0.05);各给药组大鼠FBG均显著降低(P<0.01);二甲双胍组及大黄黄连泻心汤加味高、中剂量组大鼠血清中GSP、GLU、TG、LDL-C水平均明显降低(P<0.05,P<0.01);二甲双胍组和大黄黄连泻心汤加味高剂量组大鼠血清TC水平显著降低(P<0.01),各给药组大鼠血清HDL-C水平均明显升高(P<0.05,P<0.01);二甲双胍组和大黄黄连泻心汤加味高、中剂量组附睾脂肪HIF-1α、BNIP3、LC3B mRNA及蛋白表达明显降低,UCP1蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01);二甲双胍组和大黄黄连泻心汤加味高剂量组p62、Dio2、Prdm16 mRNA及p62蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论:大黄黄连泻心汤加味可能通过HIF-1α/BNIP3/LC3B途径抑制内脏脂肪组织线粒体自噬,促进脂肪棕色化,改善肥胖T2DM糖脂代谢。

落新妇苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及机制

目的探究落新妇苷(AST)对大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的影响,以及可能的作用机制。方法将SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组(复方丹参片240 mg/kg)和AST低、高剂量组(30、90 mg/kg)以及AST高剂量+缺氧诱导因子1α(HIF-1α)抑制剂组(AST 90 mg/kg+2-甲氧基雌二醇15 mg/kg),每组25只。除假手术组外,其他各组大鼠均建立MIRI模型,灌胃或腹腔注射相应药物或生理盐水,连续28 d。测定各组大鼠血清中心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量,测量心肌梗死体积比,观察心肌组织病理形态变化、心肌细胞凋亡率和心肌组织线粒体的超微结构,测定心肌组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及HIF-1α、腺病毒E1B相互作用蛋白3(BNIP3)、肌球蛋白样Bcl-2结合蛋白(Beclin1)的表达,并计算微管相关蛋白轻链3(LC3)Ⅱ与Ⅰ的比值(简称“LC3Ⅱ/Ⅰ”)。结果与模型组比较,阳性对照组和AST低、高剂量组大鼠的心肌组织无明显肿胀,心肌纤维排列整齐,心肌梗死体积比和c TnI、CK-MB、TNF-α、IL-6、MDA含量以及细胞凋亡率均显著降低(P<0.05),SOD活性和HIF-1α、BNIP3、Beclin1蛋白表达量以及LC3Ⅱ/Ⅰ均显著升高(P<0.05)。HIF-1α抑制剂可显著削弱AST对MIRI模型大鼠上述指标的改善作用(P<0.05)。结论AST可以通过激活HIF-1α/BNIP3信号通路来增强线粒体自噬,从而减轻大鼠MIRI。

益气活血方调节自噬促进破裂型腰椎间盘突出症重吸收

目的观察益气活血方对破裂型腰椎间盘突出症模型大鼠的干预作用,探讨其促进破裂型腰椎间盘突出症重吸收的作用及机制。方法将75只雄性SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组,模型组,益气活血方高、中、低剂量组(15.48、7.74、3.87 g/kg),每组15只。除假手术组外,其余各组大鼠建立破裂型腰椎间盘突出症模型,各给药组大鼠灌胃益气活血方,假手术组和模型组给予等量生理盐水,每天给药1次,连续8周。磁共振成像(MRI)评估大鼠椎间盘突出严重情况;HE及Masson染色观察椎间盘组织形态学变化;ELISA检测血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)水平;免疫组织化学法检测椎间盘组织中微管相关蛋白轻链3B(LC3B)、苄氯素1(Beclin-1)阳性细胞百分比;蛋白质印迹法(Western Blot)检测椎间盘组织中VEGF、LC3B、p62、核因子κB(NF-κB)p65、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、Bcl-2-腺病毒E1B相互作用蛋白3(BNIP3)、Beclin-1蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测椎间盘组织中TNF-α、NF-κB p65、HIF-1αmRNA表达。结果干预4、8周后,与假手术组比较,模型组大鼠L_(4)-L_(5)、L_(5)-L_(6)髓核信号降低,与纤维环界限模糊,Pfirmann分级评分显著增加(P<0.05);TNF-α、VEGF含量升高(P<0.05),椎间盘组织中Beclin-1、LC3B阳性细胞及蛋白表达增加(P<0.05),NF-κB p65、HIF-1α、BNIP3、Beclin-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05),TNF-α、NF-κB p65及HIF-1αmRNA表达增加(P<0.05)。与模型组比较,益气活血方高、中、低组髓核细胞形状较完整,纤维环轻度紊乱;椎间盘组织中LC3B、Beclin-1阳性细胞比率增加(P<0.01);血清中VEGF、TNF-α表达增加(P<0.05);椎间盘组织中VEGF、LC3B、NF-κB p65、HIF-1α、BNIP3、Beclin-1蛋白表达增高(P<0.05),P62蛋白表达降低(P<0.05);NF-κB p65、TNF-α及HIF-1αmRNA表达升高(P<0.05)。结论益气活血方能促进破裂型腰椎间盘突出症重吸收,具体机制可能与其促进椎间盘新生血管VEGF表达,聚集炎性因子TNF-α激活NF-κB信号通路,通过NF-κB信号通路实现HIF-1α高表达,进一步正向调控HIF-1α/BNIP3/Beclin-1通路,增强椎间盘的自噬水平有关。

温阳化浊通络方对硬皮病小鼠肺微血管损伤的影响

目的研究温阳化浊通络方基于线粒体自噬对硬皮病小鼠肺微血管损伤的影响。方法将50只小鼠随机分为空白对照组(0.9%NaCl,灌胃)、对照组(0.9%NaCl,灌胃)、模型组(0.9%NaCl,灌胃)、温阳化浊通络方组(47 mg·kg^(-1)·d^(-1)温阳化浊通络方,灌胃)、阳性对照组(10 mg·kg^(-1)·d^(-1)KC7F2溶解于磷酸盐缓冲液,腹腔注射),持续给药4周。以免疫组化法检测肺组织线粒体外膜易位酶20(TOMM20)及缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、B细胞淋巴瘤-2/腺病毒E1B-19kDa相互作用蛋白3(BNIP3)、PTEN诱导性肌酶蛋白1(PINK1)、E3泛素连接酶(Parkin)的表达水平;以蛋白质印迹(Western blot,WB)法检测肺组织微血管内皮细胞线粒体自噬相关蛋白TOMM20、LC3B及HIF-1α/BNIP3/PINK1/Parkin通路蛋白表达水平。结果对照组、模型组、温阳化浊通络方组和阳性对照组小鼠肺组织微血管内皮细胞HIF-1α相对含量分别为0.17±0.02、0.98±0.01、0.66±0.03和0.48±0.01,BNIP3相对含量分别为0.40±0.02、0.74±0.01、0.56±0.01和0.60±0.02,PINK1相对含量分别为0.26±0.04、0.88±0.01、0.65±0.02和0.67±0.02,Parkin相对含量为分别为0.33±0.02、0.89±0.01、0.65±0.02和0.77±0.02,TOMM20相对含量分别为1.10±0.02、0.58±0.01、1.02±0.01和0.98±0.03,LC3B-Ⅰ/LC3B-Ⅱ相对含量分别为0.24±0.01、0.80±0.01、0.53±0.02和0.70±0.02。模型组中HIF-1α、BNIP3、PINK1、Parkin、LC3B-Ⅰ/LC3B-Ⅱ蛋白含量高于对照组,温阳化浊通络方可有效降低其含量;模型组中TOMM20含量低于对照组,温阳化浊通络方可有效提高其含量。结论温阳化浊通络方可能通过增加TOMM20和抑制LC3B及HIF-1α/BNIP3/PINK1/Parkin信号通路的蛋白表达,进而抑制线粒体自噬,改善SSc肺微血管损伤。