H9c2细胞对B组柯萨奇病毒3型重组株的易感性

H9c2细胞是来源于大鼠胚胎心脏组织的成肌细胞系,B组柯萨奇病毒(group B Coxsackievirus,CVB)是心肌炎和扩张型心肌病的主要病原。本研究观察了CVB3在H9c2细胞中的感染性,探讨H9c2细胞是否可用于CVB致心肌疾病的实验研究。用整合了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)或海肾荧光素酶(RLuc)的CVB3重组株EGFP-CVB3、RLuc-CVB3攻击H9c2细胞及大、小鼠原代心肌细胞和骨骼肌细胞,应用荧光显微镜、流式细胞术和化学发光技术观察感染细胞的EGFP和RLuc表达,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测病毒在核酸水平的表达。结果显示,在病毒攻击的H9c2细胞未检测到EGFP和RLuc表达;RT-PCR显示在CVB3感染9 d后检测不到CVB3 RNA;CVB3毒株可感染小鼠心肌细胞、骨骼肌细胞和大鼠心肌细胞,但不感染大鼠骨骼肌细胞和H9c2细胞。本研究结果表明,H9c2细胞不是CVB3易感细胞,不能用于CVB3致心肌疾病的研究;该结果从病毒感染方面也支持H9c2具有大鼠骨骼肌细胞表型。

儿童急性暂时性髋关节滑膜炎与柯萨奇B组3型病毒感染的相关性研究

目的 :探讨儿童急性暂时性髋关节炎与柯萨奇B组 3型病毒的相关性。方法 :采用ELISA法检测 10 0例急性暂时性髋关节滑膜炎患儿血清及髋关节液中柯萨奇B组病毒 (CoXB)、腺病毒 (AdV )、巨细胞病毒 (CMV)、呼吸道合胞病毒 (RSV)抗体 ,其中 79例作病毒血清免疫学检测 ,2 1例作髋关节病毒学检测 ,怀疑柯萨奇病毒感染者 ,随机抽样 9例作髋关节液中的病毒分离。结果 :急性暂时性髋关节滑膜炎患儿 79例血清免疫学检测查出Coxb lgM阳性 11例 ,AdV lgM阳性 14例 ,CMV lgM阳性 8例 ,RSV lgM阳性 8例 ,3 8例阴性。 2 1例髋关节液中查出CoXB阳性 7例 ,AdV阳性 5例 ,CMV阳性 2例 ,7例阴性。同时在血液和髋关节液中查出CoXB阳性 1例 ,AdV阳性 2例。随机抽样 9例作病毒分离培养 ,1例分离出柯萨奇病毒 ,采用中和试验证实为柯萨奇B组 3型病毒 ,并经电子显微镜检查确认。结论 :柯萨奇B组 3型病毒具有感染儿童导致急性暂时性髋关节滑膜炎的可能性。

柯萨奇病毒B组3型VP1基因真核表达重组质粒的构建及免疫效果

目的构建柯萨奇病毒B组 3型 (CoxsackievirusesgroupB3,CVB3)VP1基因的真核表达重组质粒pcDNA3/VP1,并观察它对小鼠的免疫保护作用。方法从CVB3感染细胞中扩增出VP1片段 ,构建真核表达重组质粒 pcDNA3/VP1,经大量扩增纯化后 ,肌内注射免疫BALB/c小鼠 ,每次免疫后的第 6天 ,断尾取血检测CVB3中和抗体 ;3次免疫后用致死量 (10 0 0TCID50 )的CVB3感染小鼠 ,观察 pcDNA/VP1对小鼠的免疫保护作用。 结果pcDNA3/VP1重组质粒免疫小鼠后 ,能诱导机体产生中和抗体 ,各次免疫后抗体滴度分别为 <1∶5 ,1∶5 .7和1∶34.8;用致死量CVB3感染小鼠 ,pcDNA3/VP1重组质粒免疫组、pcDNA3质粒对照组及生理盐水对照组生存率分别为 30 %、2 0 %及 15 % ,3组小鼠生存率无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论 pcDNA3/VP1重组质粒在小鼠体内能够表达并能诱导机体产生中和抗体 ,抗体滴度随免疫次数增加 。

表达红色荧光蛋白重组柯萨奇病毒B组3型基因组稳定性分析

本文旨在分析含红色荧光蛋白mCherry基因的重组柯萨奇病毒B组3型(CVB3)基因组的稳定性。用重组质粒pCVB3-mCherry转染HeLa细胞,观察细胞病变和mCherry的表达。收获病毒后,用噬斑形成实验纯化病毒并测定病毒毒力。将重组病毒CVB3-mCherry在HeLa细胞中连续传代,提取第2～6代重组病毒总RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出报告基因mCherry及CVB3部分序列,进行测序分析。结果表明,pCVB3-mCherry转染的HeLa细胞出现细胞病变并表达红色荧光蛋白mCherry;从第2代开始,CVB3-mCherry出现报告基因mCherry及部分CVBVP4基因序列丢失,基因序列丢失导致病毒开放读码框架移位。本研究表明,mCherry基因序列的插入导致CVB3基因组不稳定。随着病毒的传代逐渐丢失插入的报告基因mCherry及CVB3基因组的部分序列,病毒读码框架移位,产生致死性突变株。因此,应用CVB3-mCherry时,病毒的传代次数不超过2代,否则应重新从重组质粒中收获病毒,并对每代重组病毒进行纯化和毒力测定。

一株引起无菌性脑膜脑炎柯萨奇B组3型病毒的分离和VP1基因分析

摘要目的对一株从无菌性脑膜脑炎患者中分离到的柯萨奇B组3型病毒（coxsackievirusB3，CVB3）分离株KMA103-09进行VP1区的基因特征分析。方法采用Hep-2、RD细胞对患者粪便标本进行病毒分离，肠道病毒组合血清进行鉴别，反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）扩增病毒目的片段，测序后进行VP1基因分析，用Mega4．1等软件分析处理。结果肠道病毒组合血清鉴别为柯萨奇病毒B组3型（Cox．B3），从病毒性脑膜脑炎患者粪便标本中，分离到CVB3，其VPl区的核苷酸长度为849bp，未发现核苷酸插入与丢失。与山东04433／SD／CHN／2004／CB3株、山东05280／SD／CHN／2005／CB3株及山东YZ127／SD／CHN／2005／CB3株氨基酸同源，与其余国内分离株同源性高于为99．29％，与国外毒株的同源性为95．41％-96．47％。在进化树上与AM06HZ／SD／CHN／2006／CB3株显示在同一个分支上。结论分离的肠道病毒为柯萨奇病毒B组3型（Cox．B3），分离株（KMA103—09）VP1区变异较小。

柯萨奇病毒B组3型VP1基因的体外表达和鉴定

将克隆的CVB3VP1基因亚克隆至真核表达载体 pCEP4构建CVB3VP1的真核表达质粒 pCEP4 CVB3VP1。pCEP4 CVB3VP1转染HeLa细胞 ,蛋白印迹试验证明该表达体系可以在体外表达能为CVB3中和抗体识别的VP1蛋白。

柯萨奇病毒B组3型上海分离株的基因特征分析

为探讨上海市不同来源的柯萨奇病毒B组3型(coxsackievirus B3,CVB3)菌株的循环动态变化及基因特征,本研究对分离自上海市环境污水、健康儿童和急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)病例中的CVB3菌株进行VP1区基因序列测定,并对照全球CVB3代表株进行序列相似性分析和系统发生学分析。结果显示,1989-2021年上海市不同来源的CVB3分离株共有120株,属于D、E基因亚型。上海CVB3分离株的核苷酸和氨基酸相似性差异较大,分别为78.7%~100%和93.3%~100.0%。2016年首次从上海环境污水中分离到E基因亚型CVB3,2021年再次分离到该基因亚型。2021年上海环境污水中的E基因亚型CVB3分离株与2020年的广东手足口病(hand,foot,and mouth disease,HFMD)病例CVB3分离株VP1区的核苷酸相似性较高,但上海暂未有该基因亚型感染病例报道。因此,仍须长期对环境污水和不同肠道病毒感染病例进行监测,以提高肠道病毒监测的敏感性,为肠道病毒相关疾病的诊疗提供数据支撑。

柯萨奇B组3型病毒SYBR GreenⅠRT-PCR检测方法的建立

目的建立一种灵敏、特异的柯萨奇B组3型(CV-B3)病原SYBR GreenⅠRT-PCR实时荧光定量检测方法,用于快速、准确地检测CV-B3。方法设计柯萨奇B组病毒通用引物以及VP1基因的T7启动子特异性引物,以体外转录获得的RNA为标准品,绘制标准曲线,建立CV-B3的荧光定量PCR检测方法;对检测方法的敏感度、特异性、重复性进行评价。结果该检测方法在10~10^(9)拷贝/微升范围内具有良好的扩增效率和线性关系,最低检测限为10拷贝/微升,标准曲线r^(2)=0.999,扩增效率为95.7%;且对柯萨奇病毒A组6型(CV-A6)、柯萨奇病毒A组10型(CV-A10)、肠道病毒71型(EV-71)均无交叉反应,重复性实验变异系数(CV%)<2%。结论本实验建立的检测方法敏感度较高,同时具备良好的特异性及重复性,可用于CV-B3病原的临床及实验室样本的定性定量检测。

黄芪甲苷对柯萨奇B组3型病毒感染乳鼠心肌细胞及病毒性心肌炎乳鼠心肌细胞的修复作用观察

目的观察黄芪甲苷(Astragaloside Ⅳ,AsⅣ)对柯萨奇B组3型病毒(coxsackie virus B3,CVB3)感染的乳鼠心肌细胞和病毒性心肌炎(VMC)乳鼠心脏的修复作用,并探讨其可能作用机制。方法 ①分离培养原代乳鼠心肌细胞,测算AsⅣ对乳鼠心肌细胞的最大无毒浓度(TC0),取乳鼠心肌细胞分为正常对照组、病毒对照组、AsⅣ组。病毒对照组和AsⅣ组分别用1000 TCID50的CVB3病毒感染心肌细胞。AsⅣ组分为五个亚组,细胞长至单层细胞时,分别加入20、10、5、2.5、1.25 mg/L的AsⅣ,当病毒对照组中75%以上的细胞出现病变时结束培养。 MTT法观察各组细胞存活情况(以OD值表示),收集各组细胞上清液,全自动生化分析仪检测乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CK-MB)含量。②75只小鼠分为正常对照组、模型对照组、AsⅣ高剂量组、AsⅣ中剂量组、AsⅣ低剂量组,每组15只。除正常对照组外,其余各组小鼠均腹腔注射1000 TCID50的 CVB3病毒液0.1 mL/只,建立VMC动物模型。接种病毒24 h时,AsⅣ高、中、低剂量组分别给予4、2、1 g/kg的AsⅣ灌胃,正常对照组、模型对照组每日予0.5%羧甲基纤维素钠20 mL/kg灌胃,各组均灌胃7 d,灌胃第8 d脱颈椎处死小鼠,取心肌组织,观察心肌组织病理学变化,全自动生化分析仪检测各组小鼠血清中LDH、CK-MB含量。结果与空白对照组比较,病毒对照组及AsⅣ组各亚组细胞OD值降低( P 均<0.05);与病毒对照组比较,及AsⅣ组各亚组细胞OD值降低( P 均<0.05)。与正常对照组比较,病毒对照组心肌细胞LDH、CK-MB含量升高( P 均<0.05);与病毒对照组比较,10、20 mg/L的AsⅣ组心肌细胞LDH、CK-MB含量降低( P 均<0.05)。与空白对照组比较,病毒对照组心肌组织排列紊乱,淋巴细胞和单核细胞出现介导的炎性浸润、心肌细胞出现明显出血水肿甚至坏死。AsⅣ组不同剂量心肌组织排列紊乱情况轻,淋巴细胞和单核细胞出现介导的炎性浸润、心肌细胞轻微出血水肿,心肌组织坏死以点状炎症和坏死灶为主。与空白对照组比较,模型对照组心肌细胞LDH、CK-MB含量升高( P 均<0.05);与模型对照组比较,AsⅣ高、中、低剂量组心肌细胞LDH、CK-MB含量降低( P 均<0.05)。结论 AsⅣ对CVB3感染的心肌细胞和VMC乳鼠心肌细胞均具有明显的保护作用,其机制可能为AsⅣ降低LDH、CK-MB含量。

柯萨奇病毒B组3型基因组剪切片段的序列分析

柯萨奇病毒B组(Coxsackievirus B,CVB)感染细胞时其基因组RNA存在不稳定现象,但产生机制尚不清楚。本研究将柯萨奇病毒B组3型(CVB3)感染细胞后,利用5′cDNA末端快速扩增技术(5′rapid amplification of cDNA ends,5′RACE)扩增并克隆细胞内CVB3基因组片段,并对每条序列及其5′端的二级结构进行分析。结果获得的20条CVB3基因组片段,长度为2067~5547bp,片段断端主要分布于2Apro和2C编码区。RNAfold分析显示,这些片段多数在5′断点端形成二级茎-环结构。本研究显示,CVB在宿主细胞感染时可形成大量不完整基因组RNA片段,这些片段可在5′断点端形成局部双链结构,提示片段不是随机产生,可能是RNA酶剪切产物。此发现有助于理解CVB基因组不稳定的机制。

柯萨奇B_3病毒性心肌炎模型小鼠的免疫学指标检测

目的 :建立急性病毒性心肌炎小鼠模型并检测其免疫功能指标。方法 :腹腔注射CVB3 建立急性病毒性心肌炎小鼠模型 ,用MTT比色法检测NK、TNF、IFN的活性 ;进行小鼠心肌组织病毒分离、病理检查 ,检测小鼠体重、心脏及脾脏重量变化。结果 :CVB3 感染鼠的体重及心脏、脾脏的重量均明显减轻 ;血清中TNF活性及脾细胞诱生TNF量显著增高 ;脾脏NK活性增高 ,但脾细胞诱生IL - 2量降低 ;IFN无明显变化。结论 :急性病毒性心肌炎模型小鼠的NK活性。

苦豆子生物碱体外抗柯萨奇B3病毒的作用

目的 :研究苦豆总碱和 6种单体生物碱 (苦参碱、氧化苦参碱、苦豆碱、槐定碱、氧化槐定碱、槐果碱 )的体外抗柯萨奇B组 3型病毒 (CVB3)的作用。方法 :以盐酸胍作为阳性对照药物 ,采用细胞病变效应 (CPE)抑制法、噻唑蓝 (MTT )比色法、组织培养半数感染(TCID50 )微量法观察苦豆总碱和 6种单体生物碱的体外抗CVB3作用。结果 :苦豆总碱和 6种单体生物碱均有明显的抗CVB3作用 ,对CVB3的抑制指数均 >2 ,细胞保护率最高可达 95 % ,其中感染后给药及药物与病毒先作用 2h然后加入细胞层的给药方法抗病毒效应较强。结论 :苦豆总碱和 6种单体生物碱在体外有明显抗CVB3、抑制细胞病变的作用。从不同给药方式分析可能是直接灭活CVB3和进入细胞内干扰病毒复制的作用较强。

苦豆总碱、苦参总碱体外抗柯萨奇B_3病毒的作用

目的 通过对苦豆总碱、苦参总碱的体外抗柯萨奇B组 3型病毒 (CVB3 )作用的对比研究 ,为其在临床应用提供实验依据。方法 以盐酸胍作为实验阳性对照药物 ,采用细胞培养技术及细胞病变效应 (CPE)抑制法、噻唑蓝 (MTT)比色法、组织培养半数感染 (TCID50 )微量法进行苦豆总碱、苦参总碱的体外抗CVB3 作用研究。结果 苦豆总碱、苦参总碱均有明显的抗CVB3 作用 (P <0 .0 5 ) ,对CVB3 的抑制指数均 >2 ,细胞保护率最高可达 95 % ,其中感染后给药及药物与病毒先作用 2小时然后加入细胞层的给药方法抗病毒效应较强。结论 苦豆总碱、苦参总碱在体外有明显抗CVB3 。

CVB3VP1核酸疫苗与重组腺病毒Ad/VP1联合应用的免疫效果

目的:观察柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus group B type 3,CVB3)VP1核酸疫苗pcDNA3/VP1与重组腺病毒Ad/VP1联合应用的免疫效果。方法:大量制备pcDNA3/VP1和Ad/VP1,肌肉注射免疫小鼠。4～6周龄雄性BALB/c小鼠随机分为4组:质粒组,注射pcDNA3/VP1,共3次;腺病毒组,注射Ad/VP1,共2次;质粒/腺病毒组,第1、2次注射pcDNA3/VP1,第3次注射Ad/VP1;PBS对照组。各次注射间隔时间为3周。质粒每次接种100μg/只,腺病毒每次接种4×107pfu/只。用微量中和试验和ELISA法分别检测每次免疫后血清中和抗体和IgG抗体滴度;CCK-8法检测淋巴细胞增殖活性和CTL杀伤活性;用致死量病毒感染后检测血中病毒滴度,并观察小鼠的生存情况。结果:各实验组小鼠的中和抗体和IgG抗体水平均随免疫次数增加而提高,末次免疫后,质粒/腺病毒组血清中和抗体和特异性IgG抗体滴度(31.70±1.41,2425.15±1.86)明显高于质粒组(23.78±1.37,918.96±1.36)和腺病毒组(18.88±1.22,800.00±1.63)(P<0.05);各实验组淋巴细胞增殖活性和CTL杀伤活性高于PBS对照组(P<0.05);以致死量病毒感染后,质粒/腺病毒组血清病毒滴度低于其他组(P<0.05),生存率高于其他组(P<0.05)。结论:核酸疫苗与重组腺病毒联合应用可以明显提高免疫效果。

黄芪甲苷对柯萨奇B组3型病毒性心肌炎小鼠心肌细胞修复作用的研究

目的探究黄芪甲苷(AS-Ⅳ)对柯萨奇B组3型病毒性心肌炎的保护作用及其机制,采用生物信息学分析方法进一步探索AS-Ⅳ发挥作用的潜在机制。方法60只8周龄雄性Balb/c小鼠,随机分为四组,即空白对照组(对照组)、病毒性心肌炎模型组(模型组)、AS-Ⅳ干预低剂量组(低剂量组)及AS-Ⅳ干预高剂量组(高剂量组),每组15只小鼠。低剂量组和高剂量组小鼠在病毒注射前使用AS-Ⅳ对小鼠进行预处理2周,根据实验设计,AS-Ⅳ的给药剂量分别为10、50 mg/kg,灌胃体积为3 ml/只。对照组和模型组小鼠灌胃相同体积的空白溶媒作为预处理。预处理结束后,模型组、低剂量组和高剂量组小鼠通过腹腔注射0.1 ml 103TCID50的柯萨奇B组3型病毒诱导病毒性心肌炎,而对照组小鼠腹腔注射相同体积的空白细胞悬液。病毒注射后,低剂量组和高剂量组小鼠继续进行AS-Ⅳ干预直到2周实验结束,在实验过程中每3天检测小鼠的体重和死亡情况。2周后处死小鼠,经过2周生存观察后收集外周血并分离血清,利用全自动生化分析仪检测心肌标志物水平;获得心脏组织进行分子生物学和病理学检测;使用苏木精-伊红染色法(HE)染色及Masson染色评估心肌损伤和纤维化水平;利用凋亡检测试剂盒检测心肌组织凋亡情况。然后利用生物数据库检索AS-Ⅳ干预与病毒性心肌炎相关靶点。使用string数据库及Cytoscape软件药物-靶点-疾病”网络分析,药物及疾病靶点基因取交集后使用metascape数据库进行Gene Ontology(GO)及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集分析,研究黄芪有效成分保护病毒性心肌炎的潜在分子机制。结果截至到干预后2周,对照组小鼠全部存活(15/15,100%),模型组存活6只(6/15,40%),低剂量组存活7只(7/15,47%),高剂量组存活12只(12/15,80%),四组存活率比较有统计学差异(P<0.05),其中对照组存活率高于模型组、低剂量组,有统计学差异(P<0.05);高剂量组存活率高于模型组,有统计学差异(P<0.05);而高剂量组和低剂量组存活率比较无统计学差异(P>0.05)。HE染色显示:对照组心肌细胞正常,肌纤维排列整齐,结构清晰,细胞连接紧密;模型组细胞水肿,排列紊乱,断裂,细胞间质水肿,可见炎性浸润;高剂量组和低剂量组比较模型组有不同程度的减轻,肌纤维排列较为规则,其中高剂量组改善更为明显。Masson染色显示:对照组中仅有少量胶原纤维分布于细胞间隙中,模型组中可见大量的胶原纤维分布,高剂量组和低剂量组较模型组明显减少。模型组小鼠的心肌凋亡率(72.56±6.25)%均显著高于对照组的(3.67±1.59)%、高剂量组的(22.48±4.69)%、低剂量组的(43.14±5.18)%,低剂量组高于对照组和高剂量组,高剂量组高于对照组,有统计学差异(P<0.05)。四组血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I、乳酸脱氢酶(LDH)、氨基末端脑利钠肽前体(NT-proBNP)比较均有统计学差异(P<0.05);模型组血清CK-MB、肌钙蛋白I、LDH、NT-proBNP高于对照组、低剂量组及高剂量组,低剂量组血清CK-MB、肌钙蛋白I、LDH、NT-proBNP高于对照组、高剂量组,高剂量组血清CK-MB、LDH、NT-proBNP高于对照组,有统计学差异(P<0.05);高剂量组和对照组血清肌钙蛋白I比较无统计学差异(P>0.05)。使用GeneCard数据库检索“AstragalosideⅣ”获得靶基因121个。同样的方法,在ETCM数据库检索获得272个靶基因。将所获得的靶基因去重后得到381个基因,其中lncRNA 3个,microRNA 10个。在ctdbase数据库验证及NCBI PubChem数据库查询,22个AS-Ⅳ化合物单体直接或间接与获得的368个mRNA有关。将这些靶基因纳入string数据库,选择种属为人类进行蛋白互作分析,设置相互作用的置信水平为0.4,最终获得有关联的节点数量337个,平均节点度为27.3,蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)富集P<1.0e-16,考虑相互作用显著。将1029个基因纳入string数据库,选择种属为人类进行蛋白互作分析,设置相互作用的置信水平为0.4,最终获得有关联的节点数量871个,平均节点度为70,PPI富集P<1.0e-16,考虑相互作用显著。将111个交集基因纳入string数据库,选择种属为人类进行蛋白互作分析,设置相互作用的置信水平为0.4,最终获得有关联的节点数量91个,平均节点度为33.1,PPI富集P<1.0e-16,考虑相互作用显著。通过Cytoscape软件将互作关系作图,构建病毒性心肌炎-黄芪单体化合物-靶基因网络图。获得的111个交集基因,通过MetaScape数据库进行GO分析和通路分析,获得通过富集分析发现,这些交集基因富集主要富集在白细胞介素的信号传导、急性病毒性心肌炎、高级糖基化终末产物-受体(AGE-RAGE)信号通路在糖尿病并发症等。主要的生物学过程为对刺激的反应,细胞迁移,对生物学过程的积极调节等。结论AS-Ⅳ通过减轻病毒性心肌炎炎症反应及细胞凋亡而发挥保护心肌的作用;通过生物信息学研究发现,黄芪单体化合物可能通过调节免疫和炎症反应发挥对病毒性心肌炎的保护作用。

浙江省嘉兴市2株与手足口病相关的柯萨奇病毒B3分离株的全基因组特征分析

目的分析浙江省嘉兴市2株与手足口病相关的柯萨奇病毒B3型(CVB3)毒株的全基因组序列特征,为手足口病的监测与防控提供科学依据。方法收集2021年浙江省嘉兴市辖区内7个区、县疾病预防控制中心上送至嘉兴市疾病预防控制中心的手足口病监测样本,经实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription PCR,real-time qRT-PCR)检测后,选取肠道病毒核酸通用阳性的样本接种于人横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)细胞和人喉癌上皮(human larynx carcinoma,HEp-2)细胞进行病毒分离培养,对产生细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)的阳性分离株进行高通量测序(Illumina NextSeq 550平台),鉴定出2株CVB3,并获得其全基因组序列。利用DNAstar软件对核苷酸序列及所编码氨基酸进行同源性分析;用MEGA6软件对VP1区进行基因分型,同时进行系统进化树的绘制;采用Simplot3.5.1软件进行重组分析。结果2株CVB3毒株基因组全长分别为7352 bp和7367 bp,其核苷酸和编码区氨基酸相似性分别为93.3%和99.5%。与CVB3原型株相比,2株毒株在编码区无碱基插入或缺失,在非编码区存在个别碱基的插入或缺失,与原型株的核苷酸相似性分别为78.9%和79.1%,编码区氨基酸相似性分别为96.0%和96.1%。VP1区系统进化树分析结果显示,本研究的2株CVB3属于E基因型,与2020年广东省分离株同属于国内新发现的分支(相似性95.09%~98.18%),与国外澳大利亚、日本分离株亲缘性最近。2株CVB3的全基因组及其P1、P2、P3区基因序列系统进化树和Simplot重组分析结果显示,2株CVB3在P2和P3非结构编码区的不同区段与不同血清型的肠道病毒有型间重组现象。结论嘉兴市的2株CVB3毒株属于国内新发现的E基因型,有重组现象,需关注CVB3的流行潜力并加强监测。

广东省2020年首次报道E基因型柯萨奇病毒B组3型的鉴定及基因特征分析

柯萨奇病毒B组3型(Coxsackievirus B3,CVB3)是肠道病毒中流行较为广泛的血清型之一,在全球多个国家和地区曾报道儿童急性心肌炎、无菌性脑膜炎、手足口病等的暴发流行,严重威胁儿童健康和公共卫生安全。本研究对广东省2020年手足口病患者标本中分离到的8株CVB3进行基因特征和进化分析,结果显示分离到的8株CVB3 VP1区核苷酸序列相似性为98.2%~99.5%,与原型株Nancy的核苷酸序列相似性在77.9%~78.5%之间,与其他CVB3中国大陆流行株的核苷酸序列相似性为79.6%~82.2%。8株CVB3均为E基因型,为广东省首次报道。8株CVB3分离株在进化树上聚集,提示病毒发生了局部传播。全基因组序列分析提示2株广东CVB3分离株在非结构蛋白区有重组现象的发生。本研究为E基因型CVB3在我国的流行传播和疾病防控提供基础资料。

免疫途径和佐剂对CVB3VP1蛋白免疫效果的影响

目的:观察不同免疫途径和佐剂类型对柯萨奇病毒B组3型(Coxsackievirus group B type 3,CVB3)衣壳蛋白VP1免疫效果的影响。方法:将原核表达质粒pET-his/VP1转入E.coli BL21(DE3)pLysS中,用异丙基-1-硫代-β呋喃半乳糖苷(IPTG)诱导CVB3VP1蛋白的表达并进行纯化。首先采用不同的免疫途径(皮下,腹腔,肌肉)用VP1蛋白免疫小鼠,每组12只。然后另取小鼠分为PBS组和不同佐剂组(氢氧化铝、弗氏佐剂、Montanide ISA720),每组18只,采用肌肉注射途径免疫。每次每只小鼠注射50μg,共免疫3次,间隔3周。用ELISA和微量中和试验检测血清特异性IgG抗体和中和抗体。用CCK-8法检测淋巴细胞增殖活性和CTL杀伤活性。用致死量的CVB3攻击后,检测血中病毒的滴度并观察小鼠的存活状况。结果:在大肠杆菌中成功表达CVB3VP1蛋白。三种免疫途径比较,肌肉注射组血清中和抗体和特异性IgG抗体的水平明显高于其他组(P<0.01)。采用肌肉注射免疫时,弗氏佐剂组Montanide ISA 720佐剂组的体液免疫和细胞免疫应答的水平明显高于氢氧化铝组(P<0.05);但血中病毒的滴度低于氢氧化铝组(P<0.05)。弗氏佐剂组小鼠的生存率好于氢氧化铝组(P<0.05)。结论:采用肌肉注射途径,并联合弗氏佐剂或Montanide ISA 720佐剂可以使CVB3VP1免疫获得较好的免疫效果。

菘蓝的4种单体成分抗柯萨奇病毒作用的研究

目的 :了解菘蓝 4种有效单体 (6 ,7,8,9号 )抗柯萨奇病毒B组 3型 (CVB3 )的活性。方法 :通过观察细胞病变效应 (CPE) ,噻唑蓝 (MTT)比色法检测细胞活性 ,用半定量RT PCR检测不同药物浓度下病毒核酸含量 ,以确定有效单体抗CVB3 的作用。结果 :菘蓝的 4种单体成分对CVB3 生物合成均有抑制作用 ,且强于阳性对照药物病毒唑。表现在随着药物浓度的增加 ,CPE程度逐渐减弱 ,病毒核酸的含量逐渐下降。结论 :菘蓝的 4种单体能在体外通过抑制生物合成发挥抗CVB3 作用。

柯萨奇病毒B组3型的分子流行特征分析

目的探讨已公布的不同国家不同时间分离的人类柯萨奇病毒B组3型(human coxsackievirus B3,CB3)VP1区基因特征和分子流行特点。方法在GenBank中用BLASTN软件搜索不同国家/地区、不同时间发表的CB3VP1区基因序列,共得到来自8个国家的92个可用序列,用MEGA软件计算不同毒株的核苷酸和氨基酸差异率,并构建系统进化树。结果 92株病毒可分为5个基因型(Genotype 1～5),基因型1由CB3原型株Nancy和3个法国株组成,基因型2由4株美国株组成,基因型3的地理分布最广,由德国、美国、罗马尼亚、法国、日本、荷兰、瑞典分离株组成,基因型4由5株中国台湾分离株组成,基因型5由中国山东株、云南株和台湾株组成,该基因型又分为A～E 5个亚型。不同毒株的核苷酸差异率为6.90%～24.64%(氨基酸差异率1.00%～10.20%),不同基因型之间的核苷酸差异率为15.91%～24.64%(氨基酸差异率4.02%～10.20%)。结论不同基因型/亚型可以在同一个地区流行很长时间,同一时间内不同的基因型/亚型又可在不同的地区流行,具有明显的时间和地域流行特点。