加味小陷胸汤基于核因子-κB信号通路对非小细胞肺癌荷瘤小鼠的影响实验研究

目的:探讨加味小陷胸汤基于核因子κB(NF-κB)信号通路对非小细胞肺癌荷瘤小鼠的影响。方法:选取SPF级健康雄性C57BL/6小鼠75只,分为对照组15只和造模组60只。造模组采用人非小细胞肺癌A549细胞株右腋下接种建立非小细胞肺癌荷瘤模型,对照组给予等量生理盐水右腋下皮下注射。造模成功后,将造模组小鼠随机分为模型组、加味小陷胸汤低、高浓度组及顺铂组,各15只。模型组和对照组分别予以无菌生理盐水5 ml/kg,腹腔注射,1次/d+蒸馏水5 ml/kg,灌胃,1次/d;加味小陷胸汤低、高浓度组分别予以无菌生理盐水5 ml/kg,腹腔注射,1次/d+8 mg/ml、16 mg/ml加味小陷胸汤药液5 ml/kg,灌胃,1次/d;顺铂组予以0.4 mg/ml顺铂溶液5 ml/kg,腹腔注射,1次/d+蒸馏水5 ml/kg,灌胃,1次/d。所有小鼠均连续给药14 d。对小鼠肿瘤体积、瘤重和生长抑制率、肿瘤组织细胞凋亡率、肿瘤组织含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、NF-κB、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达水平进行检测。结果:治疗后,与模型组比较,各组小鼠肿瘤体积、瘤重较低,肿瘤组织NF-κB、Bcl-2表达水平较低,且加味小陷胸汤低浓度组>加味小陷胸汤高浓度组和顺铂组,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,各组小鼠肿瘤生长抑制率较高,肿瘤组织细胞凋亡率较高,肿瘤组织Bax、Caspase-3表达水平较高,且加味小陷胸汤低浓度组<加味小陷胸汤高浓度组和顺铂组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:加味小陷胸汤能剂量依赖性抑制非小细胞肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长,促进肿瘤细胞凋亡,其作用可能与抑制NF-κB信号通路,调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达有关。

弥漫大B细胞淋巴瘤Bcl-2、NF-κB、p-AKT及NF-κB的表达变化及意义

目的观察弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBC)患者淋巴组织B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、核转录因子(NF-κB)、C-myc基因的表达,及标本中与PI3K/AKT细胞通路相关分子的表达,分析其与DLBCL患者临床病理特征之间的关系。方法选取海南医学院第一附属医院2014—2017年收治的75例DLBCL病检存档的石蜡包埋组织样本为试验组,另选同期75例健康志愿者的淋巴组织样本纳入对照组,检测并比较两组淋巴组织中Bcl-2、NF-κB、C-myc基因的表达,及DLBCL标本中与PI3K/AKT细胞通路相关分子的表达。结果试验组淋巴组织中Bcl-2、NF-κB、c-Myc蛋白阳性表达率均显著高于对照组(P> 0.05)。Bcl-2与NF-κB、c-Myc的阳性表达在DLBCL患者淋巴组织中均呈正相关(P <0.05)。NF-κB和p-AKT在DLBCL中的表达呈明显的正相关(P <0.01)。p-AKT的表达与DLBCL临床分期呈正相关(P <0.05);NF-κB表达与DLBCL临床分期和结外累及呈正相关(P <0.05)。结论 DLBCL患者淋巴组织中Bcl-2、NF-κB、c-Myc基因高度表达,Bcl-2、NF-κB、c-Myc基因表达水平可作为DLBCL临床治疗及预后评价的指标,p-AKT抑制剂和NF-κB抑制剂的联合使用可能对DLBCL的治疗有一定价值。

龙葵碱通过调节肿瘤坏死因子-α、脂多糖受体CD14、核转录因子-κB及一氧化氮的抗胃癌作用研究

目的:观察龙葵碱对胃癌小鼠血清中肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、脂多糖受体CD14(简称CD14)、核转录因子-κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)和一氧化氮(Nitric Oxide,NO)的含量及瘤组织中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cysteine Aspartate Proteinase-3,caspase-3)、埃兹蛋白(Ezrin Protein,Ezrin)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)和Bcl2-Associated X的蛋白质(Bcl2-Associated X protein, Bax)表达水平的影响,分析其抑制胃癌的作用及机制。方法:40只BALB/C小鼠于右腋下部接种胃癌细胞株悬液制作荷瘤小鼠模型,随机分成5组即模型组、龙葵碱(高、中、低)剂量组、猪苓多糖组,酶联免疫吸附剂测定(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)法检测各组鼠血清中TNF-α、CD14、NF-κB和NO的含量变化;实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time Fluorescence Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)法检测Bax、Bcl-2、caspase-3、Ezrin基因表达情况。结果:高、中、低剂量的龙葵碱可增加胸腺和脾脏指数,抑制移植瘤生长;可减少鼠血清中CD14和NF-κB的含量,增加TNF-α和NO的含量水平;可增加Bax和caspase-3的基因表达,减少Bcl-2和Ezrin基因表达。在龙葵碱中剂量组中,上述变化较为明显。结论:在荷瘤小鼠模型中,龙葵碱可能通过下调CD14、NF-κB、Ezrin和Bcl-2的表达,上调TNF-α、NO、Bax和caspase-3的表达以达到抑制胃癌进展的作用。

丹参多酚酸对心房颤动大鼠心肌组织中VCAM-1和ICAM-1水平及ERK1/2-NF-κB信号通路的影响

目的:研究丹参多酚酸对心房颤动(房颤)大鼠心肌组织中血管细胞黏附分子1(VCAM-1)和细胞间黏附分子1(ICAM-1)水平及细胞外信号调节酶1/2-核转录因子-κB(ERK1/2-NF-κB)信号通路的影响,探讨丹参多酚酸防治房颤的可能机制。方法:48只SD大鼠随机分为对照组、房颤组和丹参多酚酸组,每组16只。舌下静脉注射氯化钙-乙酰胆碱混合液建立房颤大鼠模型。丹参多酚酸组大鼠用丹参多酚酸(4 mg·kg^-1·d^-1)灌胃,对照组和房颤组大鼠用等量生理盐水灌胃,每天1次,共4周。采用苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠心肌组织病理形态表现,Masson染色观察心肌纤维化情况,免疫组织化学染色检测各组大鼠心肌组织中基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白表达水平,Western blotting法检测各组大鼠心肌组织中VCAM-1、ICAM-1、ERK1/2、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)、NF-κB和磷酸化核转录因子κB(p-NF-κB)蛋白表达水平。结果:HE染色,对照组大鼠心肌细胞未见明显异常;房颤组大鼠心肌组织间质增多,可见炎性细胞浸润;与房颤组比较,丹参多酚酸组大鼠心肌组织间质稍多,炎性细胞浸润不明显。Masson染色,对照组大鼠心肌间质胶原纤维正常;房颤组大鼠心肌间质胶原纤维明显增多;与房颤组比较,丹参多酚酸组大鼠心肌间质胶原纤维较房颤组明显减少。与对照组比较,房颤组和丹参多酚酸组大鼠心肌组织中MMP-2、MMP-9、VCAM-1、ICAM-1、p-ERK1/2和p-NF-κB蛋白表达水平升高(P<0.05);与房颤组比较,丹参多酚酸组大鼠心肌组织中MMP-2、MMP-9、VCAM-1、ICAM-1、p-ERK1/2和p-NF-κB蛋白表达水平降低(P<0.05)。房颤组大鼠心肌组织中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平与VCAM-1(r=0.435,P<0.01;r=0.512,P<0.01)和ICAM-1(r=0.486,P<0.01;r=0.579,P<0.01)蛋白表达水平呈正相关关系。结论:丹参多酚酸可通过抑制房颤大鼠心房组织ERK1/2-NF-κB信号通路激活,降低VCAM-1和ICAM-1水平,抑制心肌纤维化,从而发挥对房颤的治疗作用。

微小RNA-184通过Janus激酶2/信号转导与转录激活因子3途径下调B细胞淋巴瘤/白血病-2样蛋白1介导骨肉瘤的化疗耐药的机制

目的探究微小RNA(miRNA,miR)-184通过Janus激酶2(JAK2)/信号转导与转录激活因子3(STAT3)信号通路影响B细胞淋巴瘤/白血病-2样蛋白1(BCL2L1)参与骨肉瘤细胞化疗耐药性的机制。方法选用骨肉瘤细胞株MG63,采用聚合酶链反应(PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)等方法检测其中miR-184表达水平以及JAK2/STAT3、BCL2L1蛋白表达;转染miR-184模拟物、抑制物序列,观察对MG63、顺铂培养下的MG63(DPP-MG63)的影响,另将JAK2/STAT3通路抑制剂AG490与细胞一起培养,观察细胞变化。采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析及组内两两比较LSD-t检验进行统计学分析。结果miR-184在骨肉瘤细胞中降低(t=9.074,P<0.05),在过表达miR-184后骨肉瘤细胞的增殖、侵袭能力减弱,凋亡率升高(F=13.810、57.090、59.660,P<0.05),且其中JAK2/STAT3通路的蛋白表达、BCL2L1蛋白(0.92±0.04)均被抑制,细胞耐药性降低(F=186.200、252.900、211.600、156.200、176.500,P<0.05),而抑制miR-184则反之。同样,在经AG490培养后,细胞的增殖、侵袭能力降低,耐药性降低,BCL2L1蛋白表达(0.84±0.05)则升高(F=11.270、38.300、77.130,P<0.05)。拯救实验显示,沉默miR-184后的细胞再与AG490进行培养,细胞生物学行为、耐药性与MG63、DPP-MG63细胞比较差异均无统计学意义(t=0.612、0.059、0.050、0.612,P>0.05)。结论miR-184通过激活JAK2/STAT3信号通路,抑制BCL2L1的表达,促进骨肉瘤细胞的生长,并降低耐药性。

微小RNA-149-5p在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达情况及作用机制

目的探讨微小RNA-149-5p(miRNA-149-5p)在弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中的表达情况及作用机制。方法选择150例DLBCL患者和70例淋巴结反应性增生患者,分别作为观察组和对照组。采用逆转录聚合酶链法检测两组患者中miRNA-149-5p的相对表达量,采用免疫组织化学染色法检测两组患者中核因子κB(NF-κB)/p65、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、胱天蛋白酶3(caspase 3)、Ki-67蛋白的表达情况。依据miRNA-149-5p表达水平,将DLBCL患者分为miRNA-149-5p高表达组和miRNA-149-5p低表达组,比较两组患者的3年生存率。结果观察组患者的miRNA-149-5p相对表达量明显低于对照组,差异有统计学意义(P﹤0.01)。miRNA-149-5p表达情况可能与DLBCL患者的Hans分型有关(P﹤0.01)。观察组患者的NF-κB/p65、Bcl-2、Ki-67蛋白阳性率均明显高于对照组,caspase 3蛋白阳性率明显低于对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。miRNA-149-5p高表达组患者的3年生存率为46.4%,明显高于miRNA-149-5p低表达组的17.5%,差异有统计学意义(P﹤0.01)。结论 DLBCL患者中miRNA-149-5p表达下调,可能通过凋亡途径影响肿瘤的发生,miRNA-149-5p低表达可能与DLBCL患者预后不良有关。

miR-181b对肝癌HepG2细胞增殖以及Bcl-2和SP1蛋白表达的影响

目的:研究miR-181b对人肝癌G2细胞(HepG2)中B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和转录因子SP1蛋白及mRNA表达的调节作用,探讨miR-181b对HepG2细胞增殖的影响。方法:用人工合成的miR-181b相应的双链互补DNA片段,插入miRNASelectTMpEGP-miR载体中,经测序鉴定后克隆microRNA的高表达质粒;用脂质体将miR-181b高表达质粒转染进HepG2细胞,经嘌呤霉素筛选获得阳性克隆。用RT-PCR技术和Western blotting方法分别检测该细胞系中Bcl-2和SP1的mRNA和蛋白表达情况。用MTT法检测HepG2细胞增殖的变化情况。结果:Western blotting结果显示miR-181b能够减少Bcl-2和SP1蛋白质的表达,RT-PCR分析显示Bcl-2和SP1 mRNA表达减少。MTT显示转染后细胞的生长速率比未转染的细胞明显减慢。结论:miR-181b抑制HepG2肝癌细胞增殖,提示可能与其下调Bcl-2和SP1的表达有关。

核结合因子-κB及bcl-2/bax在PQ中毒鼠肺组织中的表达

目的探讨NF-κβ、bcl-2/bax基因在百草枯中毒鼠所致急性肺损伤中的表达.方法 80只SD雄性大鼠分为对照组(C组30只)、百草枯中毒组(PQ组50只).PQ组一次性灌胃PQ 25 mg/kg染毒,C组予等体积生理盐水灌胃.观察各组大鼠在中毒后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d肺组织病理改变,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肺组织bcl-2和bax m RNA的表达.采用ELISA方法检测肺泡灌洗液中PMN的NF-κβp65表达.结果 C组肺组织结构完整,无炎症细胞渗出.PQ组肺组织炎性细胞浸润明显增多,且随时间推移肺损伤加重.PQ组bcl-2m RNA的表达于6 h后最强,至3 d仅有少量表;bax m RNA的表达于1 d达高峰,第5天仍有少量表达;bcl-2/bax比例为促凋亡的bax基因占优势,且随着时间的推移这种优势越来越明显;与相应点C组相比差异有统计学意义(P<0.05);PQ组染毒1d时NF-κβp65即有明显表达,3d时表达最强,5d后明显减弱,与C组比较差异有统计学意义(P<0.01).PQ组NF-κβp65与bcl-2表达呈正相关(r=0.71,P<0.01);NF-κβp65与bax表达呈负相关(r=-0.77,P<0.01).结论 NF-κβ、bcl-2/bax介导的肺细胞炎症反应可能是PQ中毒所致急性肺损伤的机制之一.

葫芦素B抑制STAT3/Bcl-2表达诱导非小细胞肺癌H1975细胞凋亡

目的探讨葫芦素B对非小细胞肺癌H1975细胞凋亡的影响及可能的机制。方法应用不同浓度葫芦素B作用H1975细胞不同时间,分别使用Annexin/7-AAD双染法检测细胞凋亡,Western blot法测定信号转导与转录活化因子3(STAT3)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白表达。结果0 nM的葫芦素B处理后24、48 h的细胞增殖抑制率分别为(2.86±0.11)、(3.21±1.26)%,20 nM的分别为(3.10±0.29)、(4.09±0.65)%,40 nM的分别为(4.09±0.12)、(7.59±0.74)%,80 nM的分别为(4.61±0.14)、(32.63±0.67)%。0、20 nM葫芦素B处理后24、48 h对H1975细胞增殖抑制率无明显影响;40、80 nM葫芦素B处理后24、48 h,对H1975细胞增殖抑制率均高于0 nM与20 nM,差异均有统计学意义(P<0.05)。葫芦素B处理后24 h的细胞增殖抑制率均低于处理后48 h,呈时间-剂量依赖性增加,80 nM葫芦素B作用48 h对H1975细胞的细胞凋亡诱导作用最为明显,差异有统计学意义(P<0.05)。40 nM以上浓度葫芦素B作用H1975细胞48 h后p-STAT3、STAT3、Bcl-2明显降低。结论葫芦素B通过抑制STAT3信号活化下调Bcl-2蛋白表达诱导H1975细胞凋亡的发生。

Bcl-2和NF-kB在大鼠酒精性肝病中的表达及相关性

目的观察大鼠酒精性肝病组织病理形态学改变,探讨细胞凋亡与Bcl-2、NF-kB的表达及意义。方法采用灌胃法制备大鼠酒精性肝病(ALD)模型,模型组用40%酒精8g/(kg.d)分二次灌胃共12周,对照组灌等量的生理盐水,实验第8、12周末分批处死动物。用HE染色及天狼星红染色观察肝脏病理学改变,用TUNEL法检测肝细胞的凋亡,用免疫组化法检测Bcl-2、NF-kB的表达。结果①模型组与对照组比较,肝细胞明显肿胀,可见大小不等的脂肪空泡,部分处可见点状、灶壮坏死,肝组织内胶原纤维轻度增生,随造模时间延长模型组病变加重。②凋亡的肝细胞主要位于肝组织中点状、灶状和碎屑样坏死区及其周围,模型组肝细胞凋亡指数明显高于对照组(P<0.05)。③Bcl-2和NF-kB阳性细胞主要分布在中央静脉及肝细胞坏死灶周围,模型组Bcl-2、NF-kB表达强度明显高于对照组(P<0.05)。④Bcl-2和NF-kB表达间存在相关性,且两者之间存在正相关关系(r=0.576,P<0.01)。结论大鼠酒精性肝病发生与肝细胞凋亡密切相关。大鼠酒精性肝病的发生、发展过程中Bcl-2和NF-kB参与肝细胞凋亡。NF-kB基因活化后,上调Bcl-2基因的表达。

磷酸化STAT3和Bcl-2在子宫内膜异位症的表达及相互关系

目的检测子宫内膜异位症(EMs)患者的在位内膜、异位内膜中磷酸化信号传导和转录激活因子3(P-STAT3)和B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白的表达情况,分析两者的相关性。方法应用免疫组化SP法检测40例内异症的在位内膜、异位内膜和40例正常子宫内膜中P-STAT3和Bcl-2的表达情况。结果 P-STAT3和Bcl-2在内异症的在位内膜和异位内膜中的表达强度高于正常子宫内膜(P<0.05)。P-STAT3和Bcl-2在异位内膜中的表达强度高于在位内膜(P<0.05)。P-STAT3与Bcl-2的表达强度在内异症在位内膜、异位内膜的增殖期和分泌期均呈正相关。结论 STAT3和Bcl-2在子宫内膜异位症的发病中可能发挥重要作用。

子宫腺肌病患者子宫内膜组织中Ki-67、bcl-2和STAT3表达变化及意义

目的观察子宫腺肌病患者子宫内膜组织中细胞核相关抗原(ki-67)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(bcl-2)及信号传导与转录激活因子3(STAT3)的表达变化,并探讨其意义。方法采用免疫组化SP法检测40例子宫腺肌病患者异位、在位内膜组织及41例正常子宫内膜组织中的ki-67、bcl-2及STAT3,并分析三者的关系。结果子宫腺肌病在位内膜和正常子宫内膜增殖期的ki-67、bcl-2阳性表达率均高于分泌期,P均<0.05。子宫腺肌病异位内膜分泌期的ki-67阳性表达率均高于同期子宫腺肌病在位内膜和正常子宫内膜,子宫腺肌病异位、在位内膜bcl-2、STAT3阳性表达率均高于同期正常子宫内膜,P均<0.05。子宫腺肌病异位、在位内膜组织中ki-67、bcl-2和STAT3的表达,两两均呈正相关,P均<0.05。结论子宫腺肌病异位内膜组织中ki-67、bcl-2及STAT3表达均升高,三者可能共同促进该病的发生发展。

基于JAK2/STAT3信号通路探讨芪苓白头翁汤对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨芪苓白头翁汤对弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞增殖、凋亡、非受体型酪氨酸蛋白激酶2/信号转导及转录激活因子3(JAK2/STAT3)信号通路及炎症因子白细胞介素^(-1)0(IL^(-1)0)的影响。方法:以人DLBCL细胞OCI-LY10、U2932细胞为研究对象,细胞增殖与活性检测法(CCK-8)检测细胞增殖情况,并计算出0、4.6、9.3、18.7、37.5、75、150 mg·L^(-1)芪苓白头翁汤处理OCI-LY10、U2932细胞24 h后的半抑制浓度(IC_(50))分别为9.33、16.13 mg·L^(-1)。后续相关实验根据芪苓白头翁汤作用于OCI-LY10、U2932细胞24 h半抑制浓度(IC_(50)),选用芪苓白头翁汤9.5、19、38 mg·L^(-1)开展实验。用胱天蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-8、Caspase-9酶原活化检测试剂盒检测经0、9.5、19、38 mg·L^(-1)芪苓白头翁汤处理OCI-LY10、U2932细胞24 h后OCI-LY10、U2932细胞中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的酶原活化情况。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测经0、9.5、19、38 mg·L^(-1)芪苓白头翁汤处理OCI-LY10、U2932细胞24 h后OCI-LY10、U2932细胞中IL^(-1)0炎症因子表达情况。流式细胞仪检测不同浓度芪苓白头翁汤作用OCI-LY10、U2932细胞24 h后细胞凋亡率及细胞周期。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测0、9.5、19、38 mg·L^(-1)芪苓白头翁汤作用OCI-LY10、U2932细胞24 h,OCI-LY10、U2932细胞中B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(cleaved PARP)、活化的Caspase-3(cleaved Caspase-3)凋亡蛋白表达情况及JAK2、STAT3、磷酸化(p)-JAK2、p-STAT3通路蛋白表达情况,不同浓度药物作用OCI-LY10、U2932细胞24 h,OCI-LY10、U2932细胞中癌基因(c-Myc)蛋白表达情况。结果:芪苓白头翁汤作用于OCI-LY10、U2932细胞24 h,与空白组比较,芪苓白头翁汤各组细胞增殖均受到明显抑制(P<0.05,P<0.01);9.5、19、38 mg·L^(-1)芪苓白头翁汤组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9酶原显著活化(P<0.01),细胞凋亡增加(P<0.05,P<0.01),细胞于DNA合成前期(G1)阻滞增加(P<0.05,P<0.01);9.5、19、38 mg·L^(-1)芪苓白头翁汤组OCI-LY10、U2932细胞中Bcl-2、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达显著降低(P<0.01),Bax、cleaved PARP、cleaved Caspase-3蛋白表达显著增加(P<0.01),JAK2、STAT3蛋白表达未见明显改变。与空白组比较,19 mg·L^(-1)芪苓白头翁汤组、19 mg·L^(-1)芪苓白头翁汤+10μg·L^(-1)IL^(-1)0组c-Myc、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达水平下降(P<0.05,P<0.01),10μg·L^(-1)IL^(-1)0组c-Myc、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达明显增加(P<0.05,P<0.01),通路蛋白JAK2、STAT3蛋白表达未见明显改变。结论:芪苓白头翁汤可以抑制人DLBCL细胞OCI-LY10、U2932细胞的增殖并促进其凋亡,其作用机制可能与芪苓白头翁汤调控JAK2/STAT3信号通路有关。

Stat3及Bcl-2在口腔黏膜癌前病变癌变中表达的相关性

目的研究转录信号转导子与激活子3(Signal transducers and activators of transcription3,Stat3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)在口腔黏膜癌前病变癌变过程中各阶段的表达及关系。方法用免疫组织化学SABC法检测9例口腔正常黏膜、8例上皮单纯增生、22例上皮异常增生和19例口腔黏膜鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)组织中Stat3和Bcl-2的表达,并用自动图像分析仪定量分析Stat3和Bcl-2蛋白的相对含量。结果随着口腔黏膜上皮从正常组织、单纯增生、异常增生发展到OSCC,Stat3和Bcl-2的阳性细胞面积指数值逐渐上升,OSCC时达到高峰,且Stat3和Bcl-2的表达呈线性正相关。结论 Stat3和Bcl-2均参与了口腔黏膜癌前病变癌变的发生发展过程。

PP2C蛋白磷酸酶调控的细胞信号通路研究进展

2C类蛋白磷酸酶是蛋白磷酸酶家族的重要成员,可以对丝/苏氨酸残基特异性脱磷酸。近来研究表明,2C类蛋白磷酸酶控制着大量关键的细胞功能,如增殖、细胞周期阻滞、衰老和细胞程序性死亡、凋亡和自噬等,因而在介导机体免疫反应、衰老、神经发育及肿瘤发生发展中发挥重要的生物学作用。总结PP2C基因各亚型参与介导的重要细胞信号通路,如丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)、转化生长因子-β(TGF-β)/Smads、核转录因子-κB(NF-κB)及DNA损伤应答通路,以期为阐明上述生理病理过程的分子基础和调控机制提供新的思路。

TLR2/NF-κB信号通路在铝致GMI-R1细胞炎症反应中的作用

目的探讨Toll样受体2(TLR2)/核转录因子(NF)-κB信号通路在铝致大鼠小胶质细胞系GMI-R1细胞炎症反应中的作用与机制。方法将对数生长期的GMI-R1细胞随机分为对照组、阳性对照组和低、中、高剂量组。3个剂量组细胞分别予浓度为100、200、400μmol/L的麦芽酚铝刺激,阳性对照组细胞予质量浓度为20 mg/L的脂多糖刺激,对照组细胞不予任何处理。培养24 h后,观察细胞形态学变化,以CCK-8法检测细胞存活率,酶联免疫吸附实验法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-12和IL-4的分泌水平,蛋白质印迹法检测TLR2、NF-κB P65、分化抗原(CD)68和CD206蛋白相对表达水平,免疫荧光法检测细胞CD68和CD206的表达。结果细胞形态学检查结果显示,随着麦芽酚铝染毒剂量的增高,GMI-R1细胞数量减少,活化状态的细胞数量增多,细胞胞质充盈程度降低,细胞突起变长,呈剂量-效应关系。阳性对照组和中、高剂量组细胞的存活率均低于对照组(P值均<0.05)。与对照组比较,阳性对照组细胞的TNF-α、IL-12分泌水平和TLR2和CD68蛋白相对表达水平均升高(P值均<0.05),IL-4分泌水平下降(P<0.05)。与对照组比较,3个剂量组细胞的TNF-α和IL-12分泌水平均升高(P值均<0.05),IL-4分泌水平均下降(P值均<0.05),且均呈剂量-效应关系。与对照组比较,3个剂量组细胞中TLR2蛋白相对表达水平均升高(P值均<0.05),中、高剂量组细胞中NF-κB p65和CD68蛋白相对表达水平均升高(P值均<0.05),但CD206蛋白相对表达水平均下降(P值均<0.05);与低、中剂量组比较,高剂量组细胞中TLR2和NF-κB p65蛋白相对表达水平均升高(P值均<0.05),CD206蛋白相对表达水平均下降(P值均<0.05)。与对照组比较,高剂量组和阳性对照组细胞中CD68平均荧光强度均升高(P值均<0.05),CD206平均荧光强度均下降(P值均<0.05)。结论铝可通过TLR2/NF-κB信号通路参与并促进GMI-R1细胞炎症反应。

葛菊护肝片调节NF-κB和Bcl-2/Bax信号通路改善酒精所致的小鼠肝脏损伤

目的:探究葛菊护肝片对酒精性肝损伤小鼠肝脏的保护作用,并基于核转录因子-κB p65(NF-κB p65)和B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)蛋白/Bcl-2相关X蛋白(Bax)信号通路探讨其作用机制。方法:SPF级雄性ICR小鼠60只,按体质量随机分为正常组、模型组、复方益肝灵片组、葛菊护肝片低、中、高剂量组。葛菊护肝片低、中、高剂量组分别灌胃0.2、0.4、0.8 g·kg^(-1)葛菊护肝片;复方益肝灵片组灌胃剂量0.16 g·kg^(-1)的复方益肝灵片,连续28 d,每天给药1次;正常组及模型组灌胃等体积纯水。第29天除正常组外,其余各组小鼠灌胃53°白酒,灌胃2次,灌胃间隔6 h;第30天取材。苏木素-伊红(HE)染色观察肝组织病理改变;透射电镜观察肝细胞超微结构改变;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测肝组织丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)、甘油三酯(TG)、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肝组织NF-κB p65、磷酸化核因子抑制蛋白α(p-IκBα)、Bcl-2、Bax蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组血清ALT、AST含量显著升高(P<0.01),肝组织MDA、TG含量显著升高(P<0.01),GSH含量显著下降(P<0.01),肝脏HE染色、油红O和电镜肝损伤评分显著升高(P<0.01);肝组织NF-κB、p-IκBα、Bax蛋白表达量均明显升高(P<0.05,P<0.01),Bcl-2蛋白表达量明显降低(P<0.05)。与模型组比较,葛菊护肝片低、中、高剂量组血清ALT、AST含量显著下降,肝组织MDA、TG含量显著下降,GSH含量显著增加(P<0.01);葛菊护肝片中、高剂量组HE和电镜评分显著降低(P<0.01);葛菊护肝片中、高剂量组小鼠肝组织NF-κB、p-IκBα、Bax蛋白表达量显著降低(P<0.01),葛菊护肝片低、中、高剂量组Bcl-2蛋白表达量显著升高(P<0.01)。结论:葛菊护肝片对ALD小鼠肝脏有一定的保护作用,其机制可能是通过下调NF-κB信号通路减轻肝组织炎症,下调Bax蛋白表达,上调Bcl-2蛋白表达抑制肝细胞凋亡实现的。

黄芪汤对12C^6+离子辐射脑损伤模型鼠Bcl-2/NF-κB信号通路的调控机制研究

目的观察黄芪汤对12C^6+离子辐射脑损伤模型鼠脑组织B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和核转录因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)蛋白表达的影响,进一步揭示黄芪汤防辐射机制。方法50只SPF级Wistar大鼠随机分为正常对照组,单纯辐射模型组,黄芪汤高、中、低剂量组(18,9,4.5 g·kg^−1·d^−1)。黄芪汤高、中、低剂量组预先给予黄芪汤灌胃2周,单纯辐射模型组和黄芪汤高、中、低剂量组大鼠脑组织于灌胃第8天给予4 Gy 12C^6+离子束单次照射,正常对照组不予照射。辐射后第7天处死各组大鼠。HE染色法观察脑组织的病理形态变化,实时荧光定量PCR法和免疫组化法分别测定各组大鼠脑组织Bcl-2、Bax和caspase-3的基因表达和蛋白表达,Western blotting法检测各组大鼠脑组织NF-κB的蛋白表达。结果与正常对照组比较,单纯辐射模型组体质量和脑系数均显著降低,脑组织Bcl-2的基因表达和蛋白表达均显著降低,Bax和caspase-3的基因表达和蛋白表达均显著升高,NF-κB的蛋白表达也显著升高(P<0.05),单纯辐射模型组大鼠脑组织出现不同程度的神经细胞数量减少,排列疏松,核固缩、深染及神经细胞周围间隙增宽。与单纯辐射模型组相比,黄芪汤中、高剂量组脑系数和脑组织Bcl-2的蛋白表达显著升高,黄芪汤高剂量组体质量和脑组织Bcl-2的基因表达均显著升高(P<0.05);而黄芪汤各干预组的NF-κB蛋白表达均显著降低,中、高剂量组caspase-3的基因表达和蛋白表达均显著降低,高剂量组Bax的基因表达和蛋白表达也均显著降低(P<0.05),高剂量组神经细胞数量减少及脑组织排列疏松等情况较单纯辐射组明显好转,但未完全恢复正常。结论黄芪汤对12C6+离子辐射所致大鼠脑损伤具有一定防护作用,其作用机制可能与促进脑组织Bcl-2/NF-κB信号通路的Bcl-2蛋白表达,抑制其Bax、caspase-3和NF-κB蛋白表达来减轻脑组织神经细胞凋亡有关。

胰岛素样生长因子结合蛋白-3通过细胞外信号调节激酶1/2信号通路调控多胶母细胞瘤增殖的机制

目的探讨胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)在胞内高表达及胞外刺激促进胶质母细胞瘤U87MG增殖的机制。方法培养胶质母细胞瘤U87MG细胞株,构建的pCMV/IGFBP-3质粒转染U87MG细胞,分为未处理组(Control)、转染pcDNA3.1(+)、空载体组(NC1)、转染pCMV-Myc空载体组(NC2)、转染pCMV-IGFBP-3组(Ⅰ)、转染pcDNA3.1(+)/ pCMV-Myc组(NC1+NC2),采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)、Western blot检测IGFBP-3、细胞外信号调节激酶(ERK)1/2、B细胞淋巴瘤/白血病-XL(bcl-XL)的表达;采用噻唑蓝(MTT)比色法分析IGFBP-3细胞因子对U87MG细胞的增殖作用,U87MG细胞经IGFBP-3于0、5、10、30 min时间段刺激后,提取的各时间段细胞总蛋白,定量后进行蛋白印迹分析,观察ERK1/2、bcl-XL蛋白的表达及ERK1/2磷酸化的变化。结果Real-time PCR显示ERK1、ERK2、bcl-XL的mRNA相对表达量为(1.32±0.45)、(1.19±0.14)、(2.83±0.56),ERK1的mRNA表达有升高趋势(P<0.01),ERK2的mRNA表达无明显变化(P>0.05),bcl-XL的mRNA明显升高(P<0.01);Western blot发现ERK1/2的灰度值(178.86±4.89,188.19±5.07)蛋白表达量无变化,但其磷酸化水平明显增强,bcl-XL的灰度值(151.85±5.71,214.37±4.71)蛋白表达量明显升高。MTT比色法检测结果表明IGFBP-3浓度的增加,细胞株呈明显增殖效应,其中500 ng/ml的IGFBP-3细胞因子刺激作用较大(P<0.01);刺激U87MG细胞株培养,蛋白印迹实验显示0、5、10、30 min、1、2 h时间段表达量,ERK1/2为163.18±4.45、159.36±5.67、161.27±3.23、172.41±4.01、177.41±2.42、169.11±1.45没有变化;pERK1/2(27.51±2.34、52.25±3.56、51.75±3.67、57.55±5.01、66.75±3.67、47.49±2.76)随时间延长而逐渐增加,2 h后出现减弱;bcl-XL(18.77±2.78、46.14±3.29、52.43±3.62、82.87±2.71、60.02±0.18、56.94±2.16)随时间延长而先增加后降低,在1 h出现下降。结论IGFBP-3胞内高表达和从胞外刺激U87MG细胞后均能增加ERK1/2下游调控基因bcl-XL的表达,进一步促进胶质母细胞瘤瘤细胞的增殖。

靶向Bcl-2克服非小细胞肺癌EGFR-TKIs获得性耐药

目的:探讨靶向抗凋亡蛋白Bcl-2克服非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药的作用及重定位Bcl-2靶向抑制剂用于克服耐药的可行性。方法:通过药物浓度梯度递增法构建非小细胞肺癌多代EGFR-TKIs耐药株,根据亲本细胞和多代EGFR-TKIs耐药的非小细胞肺癌细胞的RNA-seq数据筛选出潜在耐药相关基因Bcl-2,通过Western blot检测其在耐药细胞中的蛋白水平。为了探讨Bcl-2诱导耐药的作用,采用siRNA干扰和使用Bcl-2的抑制剂ABT199抑制Bcl-2,通过CCK8法、IncuCyte实时监测和Western blot等方法检测其对亲本和耐药细胞的细胞活力、药物敏感性、增殖和凋亡的影响。随后使用奥希替尼分别处理亲本及耐药细胞,通过WesternBlot检测NRF2受到药物作用后及在耐药细胞中的蛋白水平,并以临床公共数据库分析辅助验证。使用siRNA干扰或NRF2抑制剂ML385敲低或抑制NRF2功能,借助WesternBlot和CCK8法检测其对Bcl-2表达水平及对EGFR-TKI敏感性的影响;通过加入NRF2的激动剂Ki696探究其对Bcl-2的诱导作用、对EGFR-TKI敏感性的影响及取消靶向Bcl-2逆转耐药的作用。结果:Bcl-2在EGFR-TKIs耐药细胞中上调;敲低或抑制Bcl-2后,可选择性抑制耐药细胞的生长和活力,并诱导凋亡,且能逆转包括第三代药物奥希替尼在内的多代EGFR-TKIs耐药;EGFR-TKI可在敏感细胞中诱导NRF2的上调,且耐药细胞中上调的Bcl-2受NRF2调控。结论:EGFR-TKIs耐药细胞通过上调抗凋亡分子Bcl-2获得耐药,该分子的上调受NRF2的调控,靶向Bcl-2则可以逆转耐药。