高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白B表位诱导中和抗体能力的研究

为证实GP5蛋白B表位是否具有诱导抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)中和抗体的能力,本实验合成了PRRSV CH-1a株和高致病性PRRSV(HP-PRRSV)HuN4株B表位的短肽,分别免疫家兔制备两份特异性多肽抗血清。此外,将12头PRRSV及其抗体均为阴性的健康仔猪以HP-PRRSV HuN4疫苗毒株(HuN4-F112)进行基础免疫,然后用强毒株(HuN4-F5)进行多次接种,制备猪高免血清。间接免疫荧光检测(IFA)结果显示,两份多肽抗血清均能与PRRSV经典株和变异株发生特异性反应,IFA抗体效价无差异,表明两份血清没有显著差异。病毒中和试验结果表明,两份多肽抗血清均不具有中和PRRSV活性。间接ELISA和病毒中和试验结果表明,猪高免血清中针对B表位肽的ELISA抗体水平与血清抗PRRSV中和抗体之间没有正相关关系,而且B表位肽不能抑制中和抗体。以上结果表明HP-PRRSV B表位不能诱导产生中和抗体。

疟原虫抗原B表位NKND在鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白中的表达

疟原虫抗原B表位NKND是由本课题组首先报道的一个新的疟疾抗原表位．它是存在于多种不同疟原虫分离株中的保守序列．以减毒沙门氏菌为载体制备口服活疫苗，方法简单，使用方便，其鞭毛蛋白有较强的免疫原性，有利于激发人体的细胞和体液免疫．人工合成8肽的实验中[2]发现NKNDD可增强NKND对相应抗体的亲和力．将人工合成的NKNDD寡核苷酸片段插入鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白表达体系中，经Western杂交鉴定，表达出具有多拷贝NKNDD表位的重组鞭毛蛋白．

CD36蛋白B细胞抗原表位的生信预测及其多抗原肽的制备

目的分析CD36蛋白的结构,寻找可能的B细胞抗原表位,制备含有B细胞表位的多抗原肽(multiple antigenic peptide,MAP),为基于B细胞表位的MAP用于CD36抗体的制备提供前期实验基础。方法通过生物信息学方法分析CD36蛋白的理化性质、二级结构、潜在磷酸化及糖基化位点等,预测可能的B细胞表位。以多聚赖氨酸为核心基质,采用Fmoc方法合成含有CD36 B细胞表位的八分枝MAP,并利用反向高效液相色谱(RP-HPLC)分析MAP的纯度、质谱分析法测定MAP的分子量,对合成的CD36-MAP进行鉴定。结果CD36是1种稳定的、亲水性的碱性蛋白,二级结构以无规则卷曲为主,具有多个磷酸化、糖基化位点,抗原性较强。综合分析获得可能的优势B细胞表位4个,制备了4个含有优势B细胞表位的MAP,RP-HPLC分析表明合成的MAP的纯度均在85%以上,其中3个MAP的分子量与理论预期值相符。结论CD36具有较强的抗原性,利用预测得到的4个可能的B细胞表位合成MAP,为CD36抗体的制备和相关研究提供实验基础。

新型冠状病毒E蛋白B细胞表位的预测及鉴定

目的利用生物信息学方法预测SARS-CoV-2 E蛋白B细胞表位,并利用小鼠多抗血清、人新型冠状病毒阳性血清等进行验证,以明确SARS-CoV-2 E蛋白的优势B细胞表位。方法使用SOPMA、Expasy、SWISS-MODEL及IEDB数据库和BepiPred-2.0等软件预测SARS-CoV-2 E蛋白的结构及B细胞表位;通过大肠杆菌系统表达并纯化GST标签重组表位蛋白片段,以Western blotting和间接ELISA方法检测表位蛋白与小鼠和人SARS-CoV-2 E蛋白阳性多抗血清的反应性,以初步鉴定SARS-CoV-2 E蛋白的B细胞表位。结果表位预测结果显示,E蛋白含有线性B细胞表位Ser6-Val14和Tyr57-Pro71,构象表位涉及的氨基酸序列为Glu8-Val14、Leu39-Tyr59、Ser60-Leu65;表达并纯化含有预测表位的E蛋白片段E1(Ser6-Val14表位)、E3(Tyr57-Pro71)以及阴性对照片段E2(不含表位序列),Western blotting和间接ELISA结果均显示抗E蛋白小鼠多抗和人新型冠状病毒阳性血清只与E1、E3蛋白片段呈阳性反应而与E2蛋白片段均为阴性反应,显示E蛋白线性B细胞表位预测正确。结论本研究成功预测并初步鉴定出SARS-CoV-2 E蛋白2个线性B细胞表位,为新型冠状病毒疫苗制备和免疫应答特性分析等提供参考。

N端B细胞表位缺失的兔出血症病毒VP60蛋白的表达及其免疫原性

本研究将A3C单抗识别的VP60蛋白NTA区域作为识别标记,设计一系列编码VP60 NTA区域重叠多肽的基因序列并连接于pGEX-4T-1载体,确定A3C单抗识别的精确表位。然后构建重组质粒Bacmid-VP60△A3C,将Bacmid-VP60△A3C转染Sf9昆虫细胞,得到重组杆状病毒rBac-VP60△A3C。RT-PCR、HA、IFA和Western Blot鉴定结果表明,重组蛋白VP60△A3C在Sf9细胞中高效表达,电镜观察显示其形态和结构与兔出血症病毒VP60蛋白类似。将重组蛋白VP60△A3C以每只200μg免疫2月龄RHDV血清阴性的新西兰兔,免疫后14 d,以兔出血症病毒WF株攻毒新西兰兔。结果表明,免疫组无死亡,而对照组全部死亡。本研究结果为制备表位缺失的兔出血症亚单位疫苗奠定了基础。

B细胞抗原表位鉴定方法的研究进展

抗原表位是抗原决定其抗原性的基础,是诱导机体产生免疫应答的最小功能单位。B细胞抗原表位研究对于新型疫苗和治疗性药物的研发以及诊断试剂的开发具有重要意义。本文总结了近几年应用B细胞抗原表位研究的技术,并分析了各种技术的优缺点。

基于黏附素HpaA B细胞表位的多抗原肽疫苗的免疫原性鉴定

目的制备以幽门螺杆菌(Hp)黏附素HpaA B细胞表位为基础的多抗原肽(MAP)疫苗,并分析其免疫原性。方法在GenBank数据库检索Hp黏附素HpaA的氨基酸及核苷酸序列。采用表位分析软件预测HpaA的B细胞表位,以此合成8分支MAP并免疫白毛黑眼兔,体外试验测定MAP与兔抗Hp多克隆抗体的亲和力,体内试验检测免疫血清抗体效价和抗体的特异性。结果HpaA的优势B细胞表位可能位于其氨基酸序列的第130~142和第212~219区段,并分别以上述B细胞表位合成8分支MAP1和MAP2。MAP1和MAP2均能在体外与兔抗Hp多克隆抗体结合,且MAP1具有较高的亲和力。仅MAP1能在体内诱导免疫应答,产生高滴度特异性抗体。结论HpaA氨基酸序列的第130~142区段为其优势B细胞表位,基于此合成的MAP具有较强的免疫原性。

不同谱系D型流感病毒HEF蛋白N-糖基化位点和B细胞表位预测分析

D型流感病毒(IDV)是一种近年来新发现的正粘病毒科D型流感病毒属成员,可引起牛、猪、豚鼠等多种动物的呼吸道疾病,具有潜在的人兽共患性。基于HEF基因遗传多样性,IDV可分为5个不同的谱系,分别是D/OK、D/660、D/Yama2016、D/Yama2019和D/CA2019谱系。不同于甲型、乙型流感病毒,IDV的潜在N-糖基化位点主要集中分布在HEF基因上。为系统了解不同谱系毒株HEF蛋白的N-糖基化位点和B细胞表位,从Gen Bank数据库获得151条全长HEF基因序列,通过使用MEGA-X生物信息学软件构建遗传进化树,并用在线工具进行各毒株N-糖基化位点和线性B细胞表位预测分析。结果表明IDV的HEF蛋白具有6~8个潜在的N-糖基化位点,其中有2个N-糖基化位点(N146和N613)在不同谱系间相同,有6个N-糖基化位点(N28、N54、N249、N346、N390和N513)在不同谱系间存在差异。B细胞表位在不同谱系间有3个保守的表位和8~9个各谱系独特的表位。线性B细胞表位的预测将有助于设计激活体液反应的多表位疫苗,预测结果还需要体外和体内实验证实来证明该应用的可行性。

肠道病毒C组96型VP1蛋白线性B细胞表位筛选与鉴定

目的鉴定肠道病毒C组96型(enterovirus C96,EV-C96)VP1蛋白的线性B细胞表位。方法采用IEDB网站提供的在线分析工具分析、预测EV-C96 VP1蛋白的线性B细胞表位,结合其二级结构、β-转角、抗原性、亲水性等多项参数,筛选出优势候选表位;应用间接ELISA法检测候选表位与EV-C96免疫血清的反应性以及与21种其他常见手足口病病原血清的交叉反应性;应用微量中和试验测定表位抗体的中和效价;采用序列比对分析表位的序列保守性;应用结构对齐分析表位的结构特异性。结果通过生物信息学筛选出EVC96 VP1蛋白7个候选表位(P1~P7);ELISA法检测发现P7(氨基酸序列位置为282~304)与EV-C96多克隆抗体有强反应性,与其他常见EV多克隆抗体不发生明显反应;微量中和试验显示,P7抗体的中和效价低于1∶2;序列及结构分析结果显示,P7的氨基酸序列在EV-C96型内具有较高保守性,与其他EV相应位点氨基酸序列的结构有明显差异。结论P7表位为EV-C96特异的非中和性B细胞表位,可作为开发EV-C96检测试剂盒的候选抗原表位。

虾源肌球蛋白抗原表位的计算机辅助计算

利用在线软件和线下软件对来源于刀额新对虾(Metapenaeus ensis)的过敏原Met e1的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位进行预测、筛选以及辅助计算.首先,通过uniprot蛋白数据库获取Met e1蛋白质氨基酸序列;其次,用ExPASY ProtParam, SignalP-5.0 Server和TMHMM Server v.2.0在线工具对Met e1的理化性质、信号肽与跨膜区域进行分析,用PSIPRED在线工具、 SOPMA在线工具和DNAstar软件联合预测计算Met e1二级结构,用Swiss model在线软件预测计算Met e1三级结构;再次,用DNAStar线下软件和IEDB在线软件综合预测计算线性B细胞表位,用IEDB在线软件预测计算CD4+T细胞表位和CD8+T细胞表位;最后将所得结果进行B细胞表位和T细胞表的筛选.结果表明:Met e1蛋白的B细胞表位为15~28, 45~49, 92~95, 125~130, 150~153, 255~258位氨基酸;T细胞表位为78~84, 223~232位氨基酸.

鸭坦布苏病毒prM蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

为制备鸭坦布苏病毒(DTMUV)膜前体蛋白(prM)的单克隆抗体,将原核表达的重组prM蛋白配伍佐剂免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA筛选,获得2株能稳定分泌抗DTMUV prM蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3H4和5C10。2株杂交瘤细胞均能稳定分泌抗体,制备的腹水抗体效价分别为1∶51200和1∶102400。亚型鉴定结果显示,3H4和5C10单克隆抗体的重链均属于IgG2b,轻链均为Kappa型。Western blot和间接免疫荧光试验结果显示,这2株单克隆抗体均能与BHK-21细胞中感染的DTMUV发生特异性反应,而与同属的日本脑炎病毒无交叉反应。微量病毒空斑减少中和试验结果表明,这2株单克隆抗体均具有中和活性。进一步原核表达prM蛋白不同截短体,发现2株单抗针对不同表位,均位于prM蛋白的pr片段上。本研究制备的单克隆抗体3H4和5C10为快速检测DTMUV感染和研究prM蛋白的结构与功能奠定了基础。

人凝血因子IX的线性B细胞表位预测及鉴定

为预测并鉴定人凝血因子IX(FIX)的线性B细胞表位.通过IEDB数据库及Discovery Studio软件预测FIX的B表位和白喉毒素T结构域(DTT)的B表位,用所预测的FIX的B表位替换某预测的DTT的B表位形成DTT-表位融合蛋白.通过基因工程技术制备各重组蛋白,并免疫小鼠,通过ELISA和Western-blot检测抗血清效价和特异性,通过等温量热滴定技术(ITC)测定抗体的亲和力.预测到4个FIX的B表位.用重组蛋白FIX-2-DTT免疫的小鼠产生了识别完整FIX的抗体,该抗体具有良好的特异性,其结合常数KD为106 M-1.表明FIX-2(306 NAAINKY312)是FIX的B表位,用重组蛋白FIX-2-DTT免疫小鼠能够产生特异性识别FIX且亲和力温和的抗体.

1型登革病毒感染病人血清中非结构蛋白1B细胞线性表位鉴定

目的鉴定1型登革病毒感染病人血清中1型登革病毒非结构蛋白1(nonstructural Protein 1 of Dengue virus type 1,DENV-1 NS1)B细胞线性表位。方法以重组DENV-1 NS1为抗原,免疫印迹法筛选NS1阳性病人血清。一组重叠DENV-1 NS1的重叠多肽同这些NS1阳性血清反应鉴定NS1蛋白线性B细胞表位。采用梯度稀释的1-4型重组DENVNS1竞争抑制阳性多肽同病人血清反应鉴定其反应特异性和交叉反应性。结果12份DENV-1核酸阳性病人中筛选得到5份抗DENV-1 NS1阳性病人血清。重叠多肽法、竞争抑制法和生物信息学方法筛选出3条阳性NS1多肽(氨基酸残基序列第1-15,131-145,271-285),其中aa1-15在已报道的DENV-1分离株高度保守,提示这个区域可能存在DENV-1血清型特异性表位。aa131-145和aa271-285对应的蛋白序列比对分析表明以上区域中的133-FI/LIDGP-138和271-GKLEL/M/IDF-277在已报道的4种血清型DENV分离株中高度保守,提示这2个区域存在4种血清型DENV共同表位。结论发现3个NS1上B细胞线性表位,其中aa131-145和aa271-285为首次报道,结果有助于疫苗和诊断试剂的研发。

羊口疮病毒114蛋白的优势抗原表位预测及ORFV多表位疫苗的构建

为了探究羊口疮病毒114蛋白作为羊口疮病毒多表位疫苗靶标的可能性,试验利用在线软件ABCpred预测114蛋白的优势B细胞表位,利用在线软件IEDB的MHC-Ⅰbinding server预测114蛋白的优势细胞毒性T细胞(CTL)表位;利用IEDB的MHC-Ⅱbinding server预测114蛋白的优势辅助性T细胞(HTL)表位;使用柔性短肽接头连接114蛋白的优势B、T细胞抗原表位,构建羊口疮病毒多表位疫苗。结果:羊口疮病毒114蛋白由346个氨基酸组成,包含12个优势B细胞抗原表位,分别位于292~307 aa、264~279 aa、146~161 aa、331~346 aa、113~128 aa、298~313 aa、35~50 aa、324~339 aa、281~296 aa、162~177 aa、315~330 aa、204~219 aa;包含1个优势CTL抗原表位,位于65~73 aa;包含5个优势HTL抗原表位,分别位于69~83 aa、68~82 aa、70~84 aa、48~62 aa、284~298 aa;构建了基于114蛋白的优势抗原表位的羊口疮病毒多表位疫苗。结论:羊口疮病毒114蛋白包含多个优势B细胞和T细胞抗原表位,可作为羊口疮病毒多表位疫苗的候选靶标,具有诱导强烈体液免疫与细胞免疫反应的可能性。

重组牛乳源金黄色葡萄球菌GapC蛋白优势B细胞抗原表位的预测和筛选

旨在表达牛乳源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)GapC蛋白并对其B细胞抗原表位进行预测与鉴定,本研究利用实验室分离鉴定的S.aureus分离株15119扩增GapC基因并构建重组表达质粒pET-28a-GapC,诱导纯化得到分子量为44 kD重组蛋白GapC,以此免疫新西兰大白兔,获得特异多克隆抗体。利用生物信息学方法,对GapC蛋白的二级及三级结构进行分析,预测其B细胞抗原表位,并利用特异性抗体对筛选的表位进行鉴定。结果表明,GapC蛋白具有良好的免疫原性,筛选出7个线性B细胞抗原表位,利用兔抗重组GapC蛋白多克隆抗体鉴定得到了PL 5(^(221)IPEIDGKLDGGAQRVP^(236))多肽和PL 7(^(264)KNASNESFGYTEDEIVSSDVVGM^(286))2个优势B细胞表位。本研究成功制备了GapC蛋白,预测并鉴定了2个优势抗原表位,为其嵌合表位疫苗的开发提供了技术支持。

免疫信息学方法预测针对中东呼吸综合征冠状病毒的T/B细胞抗原表位

目的通过免疫信息学方法预测针对中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的T/B细胞抗原表位。方法从NCBI获取S蛋白序列后,运用MEGA11进行多序列比对及系统发育树构建,Expasy Protparam分析其理化性质,SOPMA预测其二级结构。随后对S蛋白建模并进行模型验证。再通过NetCTL-1.2、NetMHC pan EL 4.1和IEDB预测杀伤性T细胞(CTL)表位,NetMHCⅡpan-4.0、IFNepitope和IL-4pred预测辅助性T细胞表位(HTL),ABCpred和BepiPred-2.0预测线性B细胞表位(LBL),ElliPro工具预测构象B细胞表位(CBL)。最后对上述预测得到的线性表位进行抗原性、致敏性和毒性预测。结果S蛋白序列保守性较高,且来自不同国家的100个MERS-CoV S蛋白可以装进同一系统进化枝。理化性质分析结果显示,S蛋白亲水性总平均值为-0.078,在哺乳动物网织红细胞中半衰期约为30 h。模型验证结果显示构建的S蛋白模型是合理的。从S蛋白中预测得到具有抗原性、无致敏性和无毒性的CTL表位2个、HTL表位2个,LBL表位15个。ElliPro工具预测得到的CBL表位5个。结论MERS-CoV的S蛋白是亲水性的稳定蛋白;综合多种生物信息学方法可以预测得到T/B细胞抗原表位,对开发针对MERS-CoV的多肽疫苗具有重要借鉴意义。

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突蛋白的B细胞及T细胞抗原表位的生物信息学分析

目的使用生物信息学方法预测严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突蛋白(S蛋白)的结构特点,并预测可能的B细胞和T细胞表位。方法从NCBI数据库中获取SARS-CoV-2的S蛋白氨基酸序列,通过蛋白质基本性质分析工具ProtParam分析S蛋白的理化性质;利用综合性序列工具软件Lasergene和蛋白质二级结构分析软件SOMPA分析S蛋白二级结构;蛋白质同源物/类似物Y识别引擎Phyre2和分子图像观察软件Rasmol构建并分析S蛋白三级结构;B细胞表位预测工具ABCpred、BepiPred和BcePred预测S蛋白的B细胞抗原表位;利用免疫表位数据库IEDB预测S蛋白的T细胞抗原表位。结果S蛋白由1273个氨基酸组成,理论等电点为6.24,原子组成为C_(6336)H_(9770)N_(1656)O_(1894)S_(54),属于稳定亲水性蛋白。Lasergene软件的Gramier-Robson方法预测显示:α螺旋占23.5%、β折叠占53.7%、转角区域占14.9%、无规则卷曲占8.33%;Lasergene软件的Chou-Fasman方法预测显示:α螺旋占20.9%,β折叠占35.5%,β转角占35.2%。同时,使用SOPMA在线服务工具分析S蛋白二级结构,其中α螺旋占28.59%,延长链占23.25%,β转角占3.38%,无规则卷曲占44.78%。ABCpred、BepiPred和BcePred分别预测S蛋白的潜在B细胞抗原表位数量为5个、11个、6个。IEDB预测的CD8^(+)T细胞表位和CD4^(+)T细胞表位结果中分别选择各人类白细胞抗原(HLA)基因型亲和力最好的5个表位。结论采用生物信息学方法预测SARS-CoV-2的S蛋白具有多个B细胞及T细胞抗原表位。

无乳链球菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶C的B细胞抗原表位预测与鉴定

旨在表达牛源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)甘油醛-3-磷酸脱氢酶C (GapC)蛋白并对其免疫效果进行评估,预测并鉴定其优势B细胞抗原表位。本研究对无乳链球菌X16087株的GapC基因扩增,构建重组质粒pET-28a-WR-X16087,经诱导表达后纯化GapC蛋白,免疫小鼠并分析免疫效果。对GapC蛋白进行生物信息学分析,预测并鉴定其B细胞表位。结果表明,重组质粒经诱导表达纯化后,获得大小为44 kDa的目的蛋白,免疫小鼠后抗体效价可达1∶218 700,抗体亚型以IgG1和IgG2b为主;小鼠免疫后保护率可达100%;GapC免疫后可显著减少攻击后小鼠肝、脾、肺、肾中的菌体载量;GapC蛋白可减少细菌入侵对小鼠造成病理损伤。预测并筛选了GapC的B细胞表位,确定了3个具有良好抗原性的B细胞线性表位,分别为:~(46)KYDTTQGRFDGTVEVKDG~(63)、~(121)TAPGGNDV~(128)、~(186)MVLDGPHRGGDLRRAR~(201)。鉴定表明,3个B细胞表位有成为牛源无乳链球菌预防性表位疫苗的潜力。

羊口疮病毒ORFV113蛋白的主要特性及B细胞和T细胞抗原表位预测

为了预测羊口疮病毒ORFV113蛋白的主要特性及其优势B细胞和T细胞抗原表位,分别利用在线软件ProtParam预测ORFV113蛋白的理化性质,DeepTMHMM预测其跨膜区,SignalP 6.0预测其信号肽,SOPMA预测其二级结构,PSORT预测其亚细胞定位,ABCpred预测其优势B细胞表位,IEDB预测其优势细胞毒性T细胞表位。结果:ORFV113蛋白由208个氨基酸组成,为不稳定亲水性蛋白,分子质量约22.08 ku,理论等电点(PI)为4.36,在3~25 aa处存在1个跨膜区,不含信号肽,主要定位于细胞质膜;ORFV113蛋白的二级结构由延伸链(16.35%)、α-螺旋(23.08%)、β-转角(4.81%)、无规则卷曲(55.77%)组成;ORFV113蛋白存在11个优势B细胞表位,分别位于164~179 aa、62~77 aa、132~147 aa、120~135 aa、138~153 aa、101~116 aa、56~71 aa、188~203 aa、175~190 aa、49~64 aa、108~123 aa;存在3个优势T细胞表位,分别位于63~71 aa、121~129 aa、162~170 aa。结论:ORFV113蛋白为亲水性的跨膜蛋白,含有多个优势B细胞和T细胞抗原表位,可作为多表位疫苗的靶点。

静脉应用核小体H2B表位肽防治小鼠实验性系统性红斑狼疮的研究

目的探讨静脉途径应用基于核小体的表位肽防治系统性红斑狼疮(SLE)的可行性。方法以凋亡细胞诱导的SLE样症状小鼠为模型,用核小体表位肽H2B14￣28静脉途径诱导小鼠免疫耐受,观察实验小鼠自身抗体产生情况以及SLE样临床症状改善情况。结果用表位肽H2B14￣28诱导免疫耐受以后,可显著降低实验小鼠抗核抗体(ANA)、抗双链DNA(dsDNA)抗体、抗RNP抗体和抗心磷脂(ACL)抗体的产生,同时显著改善小鼠蛋白尿、白细胞低下、肾脏免疫复合物沉积程度和病理损伤程度。结论静脉途径应用核小体表位肽H2B14￣28可有效阻止实验性SLE病变的形成,基于核小体表位肽的肽疫苗的研究有可能为SLE的防治开辟一条全新的思路和途径。