酶解牛乳铁蛋白制备乳铁素B的酶解条件研究

乳铁素B是牛乳铁蛋白经胃蛋白酶酶解后所得到的最重要的抗菌肽,乳铁蛋白酶解生成乳铁素后抗菌活性大大增强。通过正交试验确立了牛乳铁蛋白酶解制备乳铁素B的最佳条件,指出在底物质量浓度为50g/L,酶与底物质量浓度比为1∶30(质量比),酶解时间为60min时所得的乳铁素质量浓度及活性较好。

B2有序铁铝化合物加锰后的价电子结构

利用透射电镜分析了加锰后B2有序铁铝化合物的微观结构,并运用固体经验电子理论探讨了微量元素锰加入后对B2有序铁铝化合物价电子结构的影响。结果表明:在B2有序结构中,锰原子占据Ⅱ亚点阵位置的倾向较大。微量锰加入铁铝B2有序结构使铁铝原子间最近邻位键强有所增加、铁铁原子间最近邻位键强有所减弱;微量锰的加入可增加合金的B2有序倾向。

高温高压阀门密封面喷熔铁547B合金研究

用氧-乙炔焰加熔剂助熔一步法,在12Cr1MoV珠光体耐热钢和25#钢高温高压阀门密封面基体上喷熔铁547B合金粉末,对喷熔工艺和喷熔层的硬度、时效硬化特性、热耐久性能、抗擦伤性能等使用性能进行了较为系统的试验,研究证明:用喷熔铁547B合金粉末工艺修复电站高温高压阀门密封面裂纹是可行的。

乳铁素B的抗菌活性及其影响因素

乳铁素B是牛乳铁蛋白经胃蛋白酶酶解后得到的最重要的抗菌肽,具有较强抗菌活性. 研究表明,乳铁素B对大肠杆菌的最小抑菌质量浓度为0.5 mg/mL,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.4 mg/mL;葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、牛血清白蛋白(BSA)、尿素、硫酸铵在0～10 mg/mL,乳糖、可溶性淀粉在0～4 mg/mL的质量浓度范围内,对乳铁素B的抗菌活性影响不大;当NaCl或KCl的浓度为25～100 mmol/L,MgCl2或CaCl2的浓度为1.0～5.0 mmol/L时,乳铁素B的抗菌活性就会大大降低;随着缓冲盐浓度和有机酸浓度(25～100 mmol/L)的增大,乳铁素B的抗菌活性呈下降趋势,且在微碱性环境下乳铁素B表现出较强的抗菌活力.

铁547B合金热喷熔技术的应用研究

用氧—乙炔焰加熔剂助熔一步法在12Cr1MoV珠光体耐热钢和25号钢高温高压阀门密封面基体上喷熔铁547B合金粉末,对喷熔工艺和喷熔层的硬度、时效硬化特性、热耐久性能、抗擦伤性能等使用性能进行了较系统的试验研究。试验证明:用喷熔铁547B合金粉末工艺修复电站高温高压阀门密封面裂纹是可行的。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌转铁结合蛋白B基因的克隆与表达

参照猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)血清1型菌株,设计1对特异性引物,PCR扩增转铁结合蛋白B(tbpB)全基因,克隆到pMD19-T Simple载体中,经测序比较,与参考序列的核苷酸同源性达99.72%。试验将tbpB基因定向克隆到pET-32a(+)中,转化BL21(DE3),经诱导后,SDS-PAGE结果显示转铁结合蛋白B得到表达,Western blot检测呈阳性。

国家同步辐射实验室储存环中Q铁水平位移的准直与校正研究

Q铁(四极铁)在同步加速器或储存环中担任聚焦元件,如果它们的横向位置偏离了设计值,加速器将产生束流轨道的畸变。本工作主要研究在通过平面网测量获得各Q铁的水平位置偏移时,通过轨道的拟合,使需要调节的Q铁数量和径向位移调节量尽量小的一种方法,在储存环的位移准直监测和调整方面具有实际意义。

Lactoferricin B基因与几种变异克隆的构建及其在酿酒酵母中的表达与鉴定

目的构建牛乳铁多肽(Lactoferricin B)的真核表达质粒pYES2/Lactoferricin B,实现其在酿酒酵母S.cerevisiae中的表达,并初步检测其不同变异的体外抗菌活性。方法通过分别合成Lactoferricin B基因两条单链的部分序列,让其互为模板、引物进行PCR扩增,得到Lactoferricin B与3种变异的基因序列。将它们克隆到穿梭质粒pYES2中,构建pYES2/Lactoferricin B及3种变异基因重组质粒,转化到大肠杆菌Top10中,让其大量增殖。提取重组质粒经纯化后将其转化到S.cerevisiae中,通过营养缺陷型筛选获得重组酵母菌并通过半乳糖诱导使其表达目的蛋白。经离子交换柱纯化收集目的蛋白后,通过体外抑菌实验比较Lactoferricin B及3种变异重组蛋白的抗菌活性。结果经PCR扩增检验、DNA测序表明成功构建pYES2/Lactoferricin B与3种变异基因重组质粒。提取诱导后的蛋白进行SDS-PAGE电泳及质谱检测,证实目的蛋白的存在,相对分子质量约为3.4×103。在大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌的抑菌实验中观测到Lactoferricin B和A17-Lactoferricin B产生了抑菌圈。结论成功构建pYES2/Lactoferricin B及变异基因重组质粒,该重组质粒能在S.cerevisiae中诱导表达目的蛋白,为进一步研究其生物功能及抗菌活性奠定了基础。

猪胸膜肺炎放线杆菌转铁结合蛋白B F190A突变及免疫原性

猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是造成猪肺炎和胸膜炎的重要病原菌之一,其病死率高达80%~100%。为了寻找APP转铁结合蛋白B(transferrin binding protein B,TbpB)与猪转铁蛋白(transferrin,Tf)相互作用的关键氨基酸,以达到为APP铁摄取机制研究及相关疫苗开发奠定基础的目的,本研究在对野生型TbpB进行序列分析、三维结构建模、克隆的基础上,通过GRAMM-X分子对接软件在线预测APP TbpB与猪Tf结合的关键氨基酸,利用重叠延伸PCR(SOE PCR)技术构建突变质粒,ZYM-5052半乳糖自诱导培养基诱导大肠杆菌表达该突变蛋白后与猪Tf进行斑点结合试验,野生型TbpB、突变TbpB以及PBS分别免疫小鼠,采用间接ELISA法检测不同阶段小鼠血清中特异性抗体的水平。分子对接结果显示,预测的关键氨基酸为第190位苯丙氨酸,质粒测序结果显示,已成功将编码190位苯丙氨酸的密码子突变为编码丙氨酸的密码子;斑点结合试验结果显示,突变TbpB与猪Tf不再发生结合反应;小鼠免疫试验结果表明与野生型TbpB相比,突变TbpB可诱导产生更高水平的抗体;APP TbpB 190位苯丙氨酸在与猪Tf反应中起着关键作用,突变TbpB具有良好的免疫原性,为进一步研究TbpB的功能、结构以及开发相关疫苗奠定了理论基础。

牛源金黄色葡萄球菌铁离子调控蛋白保守性和免疫效果研究

为评价金黄色葡萄球菌铁离子调控蛋白B(IsdB)作为奶牛乳腺炎疫苗抗原的可能性,对我国分离的不同克隆复合群(CCs)3株菌的isdB基因进行序列测定、比对分析,并对XJ43(CC97)菌株的isdB基因进行原核表达、纯化,通过小鼠主动和被动免疫试验评价了其免疫保护效果。Blast分析显示,来源于不同克隆复合群菌株的isdB基因序列的同源性大于95%,说明isdB基因高度保守;IsdB蛋白主动免疫能显著降低攻毒菌对免疫鼠的损伤或免疫鼠的死亡率,而被动免疫不能降低小鼠的死亡率;用活的强毒力菌刺激产生的血清则能极显著地增加小鼠的存活率。本研究表明,虽然IsdB蛋白的主动免疫可以显著减弱金黄色葡萄球菌的致病作用,但以此单一成分为抗原的金黄色葡萄球菌疫苗的免疫保护效果具有很大的局限性。

金黄色葡萄球菌IsdB表位蛋白与HBc蛋白融合表达

目的:采用大肠杆菌表达HBc-IsdB50-285融合蛋白,探讨其在原核表达系统中的表达效果。方法:设计并克隆HBc-IsdB50-285融合基因片段,构建表达质粒pET-28-HBc-IsdB50-285,并转化入E.coli BL21,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。SDS-PAGE分析蛋白可溶性及相对分子质量;BCA法测蛋白浓度;采用免疫接种法检测重组蛋白的免疫活性。40只小鼠随机分为rIsdB+adjuvant组、HBc-IsdB50-285+adjuvant组、HBcIsdB50-285组和PBS组,每组10只,间接ELISA法检测小鼠特异性IgG效价值,采用金黄色葡萄球菌Newman株对免疫后小鼠攻毒,检测各组小鼠重组蛋白免疫保护效果。结果:表达质粒pET-28-HBc-IsdB50-285经测序及酶切鉴定证明构建正确;SDS-PAGE分析,重组蛋白以部分可溶形式存在于培养上清中,相对分子质量约为44 000,亲和纯化后蛋白质水平为1.0g·L-1。ELISA检测,使用rIsdB蛋白包被酶标板,HBc-IsdB50-285+adjuvan组小鼠血清特异性抗体滴度的效价值低于rIsdB+adjuvant组(P<0.01);使用HBc-IsdB50-285蛋白包被酶标板,HBc-IsdB50-285+adjuvant组的小鼠血清特异性抗体滴度的效价值高于rIsdB+adjuvant和HBc-IsdB50-285组。攻毒实验,HBc-IsdB50-285+adjuvant组小鼠对金黄色葡萄球菌免疫保护率低于rIsdB+adjuvant组,但差异无统计学意义(P>0.05);且其与HBc-IsdB50-285未添加佐剂组比较差异也无统计学意义(P>0.05);与PBS组比较,HBc-IsdB50-285+adjuvant组小鼠对金黄色葡萄球免疫保护率升高(P<0.01),HBc-IsdB50-285组小鼠对金黄色葡萄球菌攻毒保护率亦升高(P<0.05)。结论:HBc-IsdB50-285原核表达载体构建成功;在大肠杆菌中成功表达具有较好生物活性的HBc-IsdB50-285融合蛋白。

副猪嗜血杆菌外膜蛋白TbpB基因的克隆和表达

为了克隆和表达副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)外膜蛋白TbpB基因,试验采用基因工程的方法对已发布的HPS外膜蛋白P5序列进行相关序列分析,设计并合成引物,以HPS血清5型基因组为模板,通过PCR扩增HPS外膜蛋白P5编码基因,获得长为1 116 bp的预期基因片段。该基因编码372个氨基酸的蛋白质,预测分子质量约为41 ku,将该基因片段定向克隆至表达载体pGE X-6p-1中。结果表明:诱导表达后分子质量约为67 ku,与副猪嗜血杆菌阳性血清发生了特异性反应。说明该蛋白与抗体发生了反应,有一定免疫原性。

以金黄色葡萄球菌重组IsdB137-361为抗原的牛血清抗体间接ELISA检测方法建立

奶牛乳房炎是危害奶牛健康和影响奶业发展的重要而常见奶牛疾病,金黄色葡萄球菌(S.aureus)是引起奶牛乳房炎的重要病原菌,已经用S.aureus铁调节的表面决定簇B(IsdB)的免疫优势片段IsdB_(137-361)与其他抗原成分构建了预防S.aureus感染的奶牛乳房炎候选疫苗(命名为GIT)。为了检测该候选疫苗免疫奶牛后的IsdB_(137-361)相关抗原的血清抗体,用pGEX-6p-1表达的IsdB_(137-361)作抗原建立了牛血清抗体间接ELISA检测方法。通过对抗原包被浓度、血清稀释倍数和反应条件进行了优化,确定cut-off值检测了血清交叉反应性和敏感性。结果显示,在抗原使用浓度为2.5μg·mL^(-1)-1、血清1:1000倍稀释、cut-off值为0.45时,该方法具有良好的特异性和敏感性。表明,所建立的间接ELISA检测方法可用于IsdB_(137-361)相关抗原疫苗的免疫牛血清抗体检测。

合成甜味剂对牛乳铁素抗菌活性的影响

乳铁素B是牛乳铁蛋白经胃蛋白酶酶解后得到的最重要的抗菌肽,具有很强的抗菌活性。选取大肠杆菌为实验菌株,进行了合成甜味剂对乳铁素抑菌活性影响的研究。研究表明,在牛肉膏蛋白胨培养基中,pH7.0,菌浓为107CFU/ml的条件下,纯化乳铁素B对大肠杆菌的最小抑菌质量浓度为20μg/ml;阿斯巴甜、甜蜜素、糖精钠在0～5mg/ml的质量浓度范围内,对乳铁素B的抗菌活性都有削弱的作用;而安塞蜜在0～5mg/ml的质量浓度范围内,对乳铁素B的抗菌活性没有太大的影响。

海南黎族孕妇α-地中海贫血及机体铁蛋白、维生素B_(12)和叶酸水平分析

目的:调查海南黎族孕妇α-地中海贫血基因携带率、基因类型以及机体铁蛋白、维生素B12和叶酸水平。方法:收集海南保亭、琼中、五指山、陵水4个地区黎族孕妇EDTA-K2抗凝全血及血清标本共239例,全自动血细胞分析仪检测红细胞相关参数,化学发光免疫分析仪检测血清铁蛋白、维生素B12和叶酸含量,同时用GAP-PCR法检测α-地贫3种常见基因缺失型。结果:海南黎族孕妇α-地贫基因携带率为63.18%,保亭、琼中、五指山和陵水地区分别为63.26%、46.97%、61.36%和77.50%,以静止型和标准型为主;铁蛋白缺乏率为54.81%,保亭、琼中、五指山和陵水地区分别为46.94%、54.55%、54.55%和60.00%,其中合并α-地贫和缺铁占35.56%;维生素B12缺乏者占0.84%,叶酸缺乏者占0.42%,合并维生素B12和叶酸缺乏占0.42%。黎族孕妇贫血发生率32.22%,所有标本中小细胞低色素性贫血104例占43.51%,其中单纯α-地贫31例占29.80%;单纯铁缺乏14例占13.46%,同时合并地贫和缺铁51例占49.04%,其他8例占7.69%。血象正常者中的α-地贫95.65%为静止型。结论:海南黎族孕妇α-地中海贫血和缺铁情况较严重,而叶酸和维生素B12无明显缺乏。需要加强黎族孕妇α-地中海贫血和缺铁防治,血象检查可作为有效的筛查手段。

山羊源海藻糖比伯斯坦杆菌(Bibersteinia trehalosi)转铁结合蛋白B的克隆与功能鉴定

山羊海藻糖比伯斯坦杆菌(Bibersteinia trehalosi)是造成山羊肺炎重要病原菌之一,其转铁结合蛋白B(transferrin binding protein B,TbpB)结构与功能的研究对于阐明其致病机理有重要作用。本研究在前期分离鉴定菌株基础上,通过生物信息学分析结果显示,海藻糖比伯斯坦杆菌TbpB包含氨基小叶(N-lobe)和羧基小叶(C-lobe)。分别对该菌TbpB^ 20-581 (In-tact)、N-lobe、C-lobe进行克隆、表达与纯化,对纯化的蛋白与山羊转铁蛋白、绵羊转铁蛋白、猪转铁蛋白、牛转铁蛋白、鸡转铁蛋白进行特异性点阵杂交反应,发现山羊海藻糖比伯斯坦杆菌TbpB In-tact以及N-lobe与山羊转铁蛋白、绵羊转铁蛋白有特异结合反应,而与猪转铁蛋白、鸡转铁蛋白没有反应,山羊海藻糖比伯斯坦杆菌TbpB C-lobe与山羊转铁蛋白、绵羊转铁蛋白、猪转铁蛋白、牛转铁蛋白、鸡转铁蛋白均无反应。结果表明山羊海藻糖比伯斯坦杆菌TbpB与山羊转铁蛋白结合发生在N-lobe。