抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路对MPP+处理的SH-SY5Y细胞自噬、凋亡及PD特征蛋白表达的影响

目的探讨抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)处理的SH-SY5Y细胞自噬、凋亡及帕金森病(PD)特征蛋白α-突触核蛋白(α-syn)、酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响。方法以MPP+、PI3K/Akt激活剂胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、PI3K/Akt抑制剂LY294002作用于人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,CCK-8检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡率;吖啶橙(AO)染色检测自噬空泡;Western blot检测α-syn、TH、p62、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、p-mTOR、mTOR、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白水平。结果MPP+干预显著降低SH-SY5Y细胞存活率,且呈现剂量依赖性(P<0.05)。MPP+和IGF-1处理后SH-SY5Y细胞存活率降低,凋亡率增高(P<0.05);细胞中自噬空泡减少,LC3BⅡ/Ⅰ降低,p62蛋白水平增高(P<0.05);TH蛋白水平降低,α-syn蛋白水平增高(P<0.05);p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt与p-mTOR/mTOR增高(P<0.05)。LY294002对SH-SY5Y细胞的影响与MPP+和IGF-1相反,且LY294002可在一定程度上逆转MPP+对SH-SY5Y细胞的影响(P<0.05)。结论抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路可能对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞毒性具有保护作用。

巨噬细胞过表达miR-125b促进其凋亡

目的探讨肺结核患儿外周血单个核细胞(PBMC)中miR-125b和靶基因Raf1原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(RAF1)表达;观察miR-125b对巨噬细胞凋亡和细胞活力的调节。方法收集和分离肺结核患儿和健康儿童的PBMC,采用荧光定量PCR检测miR-125b和RAF1的mRNA表达水平,Western blot法检测RAF1的蛋白水平。THP-1巨噬细胞分别转染miR-125b模拟物(miR-125b mimic)、阴性对照模拟物(NC-mimic)、miR-125b抑制物(miR-125b inhibitor)以及阴性对照抑制物(NC-inhibitor),共培养48 h;利用Western blot法检测THP-1巨噬细胞中RAF1表达,异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双染色结合流式细胞术检测细胞凋亡,CCK-8法检测细胞活力。结果在结核患儿PBMC的miR-125b表达下调,RAF1的mRNA和蛋白水平都升高。在THP-1巨噬细胞中过表达miR-125b时,RAF1表达下调,促进巨噬细胞凋亡,降低细胞活力;在THP-1巨噬细胞中miR-125b表达被抑制时,RAF1表达升高,抑制巨噬细胞凋亡,提高细胞活力。结论结核患儿PBMC中miR-125b水平降低,上调THP-1巨噬细胞miR-125b水平促进巨噬细胞凋亡并抑制细胞活力。

非小细胞肺癌中AKT活化及与抗凋亡蛋白Survivin、Bcl-2表达的关系

目的:探讨AKT的功能活化状态p-AKT及抗凋亡蛋白Survivin、Bcl-2在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及相关性。方法:应用免疫组化的方法,检测80例NSCLC组织及35例非肿瘤性肺组织标本中p-AKT、Survivin、Bcl-2的表达,并与临床病理因素进行相关性分析。结果:p-AKT、Survivin、Bcl-2在NSCLC中高表达,阳性率分别为78.8%、61.3%、50.0%,显著高于在非肿瘤性肺组织中阳性表达0、0、11.4%(P<0.05)。p-AKT、Bcl-2在不同年龄、性别、TNM分期、组织分化组以及有无淋巴结转移组均高表达,组间对比差异无统计学意义(P>0.05)。Survivin表达与TNM分期、组织的分化程度有关(P<0.05)。p-AKT阳性表达与Survivin、Bcl-2呈正相关;Survivin与Bcl-2二者也呈正相关。结论:在NSCLC中存在AKT的活化,Survivin、Bcl-2的高表达可能与AKT的活化有关。在NSCLC中可能存在p-AKT对Survivin、Bcl-2的正向调控。

沉默CRAF基因表达对肝癌细胞侵袭和迁移的影响

目的:探讨肝癌细胞中原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(CRAF)高表达对肝细胞癌(HCC)侵袭和转移的影响,并阐明其机制。方法:以CRAF高表达的SMMC-7721细胞作为研究对象,采用shRNA技术下调CRAF表达。将SMMC7721细胞分为对照组和沉默组(shCRAF#1转染组和shCRAF#2转染组)。细胞划痕法观察各组SMMC7721细胞创口愈合指数,Transwell实验检测各组SMMC-7721细胞的穿膜细胞数,Western blotting法检测各组SMMC7721细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达水平。结果:细胞划痕实验,与对照组比较,沉默组SMMC7721细胞的创口愈合指数明显降低(P<0.05)。Transwell实验,与对照组比较,沉默组SMMC7721细胞的穿膜细胞数降低(P<0.05)。Western blotting法检测,沉默组细胞中MMP-2和MMP-9表达水平明显低于对照组(P<0.05)。结论:下调CRAF可以通过抑制MMP-2和MMP-9表达抑制肝癌SMMC7721细胞的侵袭和迁移。

吉非替尼联合中医辨证论治疗对晚期肺腺癌患者EGFR、BRAF的影响

目的:探讨吉非替尼联合中医辨证论治疗对晚期肺腺癌患者表皮生长因子受体(EGFR)、B型原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(BRAF)的影响。方法:选取2016年1月至2018年1月本院晚期肺腺癌患者100例,依据随机数字表分为吉中组和吉尼组,每组50例,吉尼组给予吉非替尼治疗,吉中组在此基础上给予中医辨证论治疗,比较两组肿瘤标志物(EGFR、BRAF)、治疗疗效、不良反应、生存情况。结果:吉中组和吉尼组治疗后EGFR、BRAF明显低于治疗前,吉中组治疗后EGFR、BRAF明显低于吉尼组,差异有统计学意义(P<0.05);吉中组治疗有效率明显高于吉尼组,差异有统计学意义(P<0.05);吉中组和吉尼组不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05);随访12个月后,吉中组生存率明显高于吉尼组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:吉非替尼联合中医辨证论治疗可有效降低晚期肺腺癌患者EGFR、BRAF水平,有利于提高临床疗效及生存预后,且安全性好,值得临床推广。

法舒地尔促进平滑肌细胞自噬和凋亡的机制研究

目的探讨法舒地尔对主动脉平滑肌细胞(VSMC)自噬及凋亡的影响以及与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的关系。方法用10%胎牛血清+DMEM培养液培养SD大鼠VSMC,并利用免疫细胞化学染色法检测传代细胞α平滑肌肌动蛋白(a-SMA)的表达情况鉴定VSMC。采用血小板源性生长因子(PDGF)诱导VSMC,并将PDGF诱导的VSMC分为空白组、对照组、法舒地尔组(30μmol/L法舒地尔)、法舒地尔+LY294002组(30μmol/L法舒地尔+25μmol/L LY294002)。采用MTT法检测各组细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率和凋亡周期,GFP-mRFP-LC3双荧光检测细胞自噬水平。采用蛋白免疫印迹法(WB)检测各组细胞Bax、Bcl-2、LC3、Beclin-1及PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的蛋白表达情况并比较分析。结果镜下观察培养细胞呈长梭形、放射性生长,出现典型的"峰-谷"样结构,a-SMA阳性表达率为99%,确认所培养细胞为高纯度主动脉VSMC。法舒地尔组细胞增殖能力低于对照组(P<0.05),法舒地尔+LY294002组高于法舒地尔组(P<0.05)。与对照组比较,法舒地尔组凋亡率及G_(0)-G_(1)期细胞比例升高(均P<0.05);与法舒地尔组相比,法舒地尔+LY294002组凋亡率及G_(0)-G_(1)期细胞比例回降(均P<0.05)。与对照组比较,法舒地尔组自噬增强(P<0.05),而法舒地尔+LY294002组的自噬则较法舒地尔组有所减弱(P<0.05)。与对照组比较,Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin1水平以及PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平升高(均P<0.05);法舒地尔+LY294002组Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin 1水平以及PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平较法舒地尔组有所回降(均P<0.05)。结论法舒地尔通过激活PI3K-AKT-mTOR信号通路抑制VSMC增殖,促进自噬及凋亡,改善血管功能。

化学介导的14-3-3蛋白翻译后修饰干预:分子胶设计及其在肿瘤治疗中的应用

蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interactions,PPIs)不仅是构建蛋白质复合体的关键途径,也是维护正常生物功能的基础。这些相互作用对于蛋白质结构及其生物学功能至关重要,并在细胞的信号传导、代谢途径和调控网络中扮演核心角色。14-3-3蛋白是一种在真核生物中广泛表达的高度保守的功能性蛋白,主要通过识别并结合其伴侣蛋白参与细胞周期控制、信号转导和能量代谢等关键生命过程。本文综述了14-3-3蛋白与其伴侣蛋白如雌激素受体α(estrogenreceptorα,ERα)、RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(RAFproto-oncogeneserine/threonine-protein kinase,C-RAF/RAF-1)和p53的PPIs失调在肿瘤的发生和发展中的角色,并集中讨论了14-3-3/ERα、14-3-3/C-RAF和14-3-3/p53分子胶的研究进展。这些分子胶通过模拟或增强伴侣蛋白的磷酸化丝氨酸位点,形成与14-3-3蛋白的共价键、盐桥和氢键,从而提高了PPIs的稳定性,并有效地干预了病理状态下的蛋白活性与信号传递。此外,本文还探讨了这种化学干预策略在临床上抑制肿瘤发展的潜力,为未来的研究方向提供了理论基础和实践指南。

电针内关穴对心肌肥厚大鼠Raf、ERK1/2及p-ERK1/2表达的影响

目的观察电针内关穴对心肌肥厚大鼠缺血心肌原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶-1(protooncogene serine/threonine-protein kinase-1,Raf-1)、细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2,ERK 1/2)和磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(phospho-extracellular signal-regulated kinase 1/2,p-ERK 1/2)蛋白表达的影响。方法清洁级健康SD大鼠40只按随机数字表法分为正常组、模型组、对照组和电针组,每组10只,除正常组正常饲养外,其余三组采用颈背部皮下注射盐酸异丙肾上腺素[isoprinosine hydrochloride,ISO,3 mg/(kg·d)]制备大鼠左心室心肌肥厚模型,共14天。电针组每天注射ISO后取"内关"穴治疗,采用连续波,频率2 Hz,强度1 m A,通电20 min,1次/天,共14天。对照组选取非穴位,内关穴外侧旁开5 mm,干预方法与电针组相同。干预结束后观察大鼠心电图并称重,麻醉后开胸摘取心脏并称重,然后分离左心室称重,并计算左心室质量指数(left ventricular weight index,LVWI)和全心质量指数(heart weight index,HWI);免疫印迹法检测左心室心肌组织Raf-1、p-ERK 1/2及ERK 1/2蛋白含量。结果与正常组比较,模型组ST段抬高幅度、HWI、LVWI、心肌组织Raf-1及p-ERK 1/2蛋白表达升高(P<0.01)。与模型组及对照组比较,电针组ST段抬高幅度、HWI、LVWI、Raf-1及p-ERK 1/2蛋白表达降低(P<0.05)。结论电针能有效调节心肌肥厚大鼠心肌缺血状况,降低心肌肥厚大鼠心脏指数、Raf-1及p-ERK 1/2蛋白含量,可能是电针通过调节Raf/MEK/ERK改善心肌肥厚的信号调节机制之一。

氧化型低密度脂蛋白通过Akt／mTOR／p70S6K通路诱导血管内皮细胞自噬

目的探讨氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein, oxLDL）对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）自噬和Akt/mTOR/p70S6K信号通路的影响。方法将培养的HUVECs分为oxLDL组和对照组，分别用100 μg/ml oxLDL和等体积磷酸盐缓冲液处理。在培养6 h和12 h后收集细胞。应用透射电子显微镜观察自噬小体，实时荧光定量聚合酶链反应检测微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3）和p62 mRNA表达，应用蛋白质印迹法检测LC3、p62、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR和p-p70S6K/p70S6K蛋白表达。结果与对照组相比，oxLDL处理组细胞内的自噬小体数量明显增多（P〈0.05），LC3 mRNA及蛋白表达水平均显著增高（P均〈0.05），而p62 mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P均〈0.05）。此外，oxLDL处理组Akt、mTOR、p70S6K磷酸化蛋白表达水平均较对照组显著降低（P均〈0.01），但Akt、mTOR和p70S6K总蛋白表达水平与对照组无显著差异。结论oxLDL可通过抑制Akt/mTOR/p70S6K信号通路诱导HUVECs自噬。

豫西南地区结直肠癌患者EGFR、KRAS、BRAF基因突变与临床病理特征的关系

目的探讨豫西南地区结直肠癌患者表皮生长因子受体(EGFR)、Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)、B-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(BRAF)基因突变与临床病理特征的关系,为结直肠癌的精准医学及靶向治疗提供依据。方法选取2014年6月—2016年12月收治的结直肠癌手术切除患者268例,采用荧光定量PCR法检测EGFR基因18、19、20、21号外显子及KRAS基因12、13位密码子和BRAF基因15号外显子突变情况,比较不同临床病理特征的EGFR、KRAS、BRAF基因突变情况。结果豫西南地区结直肠癌患者EGFR、KRAS、BRAF基因突变频率分别为30%、30%、18.6%,EGFR基因突变类型为4种,以19-Del和L858R最常见,KRAS基因突变类型主要为Gly12Asp,BRAF基因突变类型主要为V600E。EGFR、KRAS基因在男性、年龄≥60岁患者中突变率均高于女性、年龄<60岁患者(均P<0.05),不同肿瘤部位、浸润深度及淋巴结转移的EGFR、KRAS、BRAF基因突变率比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论豫西南地区结直肠癌患者中,EGFR、KRAS基因突变与性别、年龄有关,BRAF基因突变与患者性别、年龄无关,EGFR、KRAS、BRAF基因突变与肿瘤部位、浸润深度及淋巴结转移均无关。

永久性大脑中动脉闭塞大鼠梗死周围组织p-Akt(Ser473)、p-Bad(Ser136)表达与细胞凋亡

目的探讨永久性大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠脑梗死周围组织P—Akt（Ser473）、p-Bad（Serl36）表达的变化及其与细胞凋亡关系。方法60只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术、MCAO3h、MCAO12h、LY294002干预MCAO3h和LY294002干预MCAO12h组，每组12只。改良线栓法制作永久性MCAO模型，LY294002干预组在模型制作前15n血经侧脑室给药。采用Longa法进行神经功能评分，氯化三苯基四氮唑（2,3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）法检测梗死体积，免疫组织化学染色法检测梗死周围组织p-Akt（Ser473）和p-Bad（Serl36）表达，TUNEL法检测梗死周围组织凋亡细胞。结果模型制作后3h，所有实验大鼠均从麻醉中清醒。假手术组神经功能缺损评分为0分，MCAO3h组、MCAO12h组、LY294002干预MCAO3h组和LY294002干预MCAO12h组分别为（2．25±0．45）、（2．92±0．99）、（3．00±0．95）和（3．02±0．36）分，各组间存在显著性差异（F=26．520，P=0．000）。其中，LY294002干预MCAO3h组显著性高于MCAO3h组（P=0．009），LY294002干预MCAO12h组与MCAO12h组无显著性差异（P=0．354）。TTC染色显示，假手术组未见梗死灶，MCAO3h组、MCAO12h组、LY294002干预MCAO3h组和LY294002干预MCAO12h组梗死体积分别为（23．4±1．4）、（40．3±1．1）、（31．9±6．0）和（44．4±3．8）mm2，各组间存在显著性差异（F=30．440，P=0．000）。其中，LY294002干预MCAO3h组显著性大于MCAO3h组（P=0．002），LY294002干预MCAO12h组与MCAO12h组无显著性差异（P=0．113）。与假手术组相比，MCAO3h组梗死周围组织p-Akt（Ser473）表达显著性增高，MCAO12h组显著性下降；p-Bad（Ser136）表达水平随着MCAO时间的推移呈现进行性下降，同时凋亡细胞数量进行性增多。LY294002干预后，MCAO3h时梗死周围组织p-Akt（Ser473）和p-Bad（Ser136）表达水平均显著性下降，凋亡细胞数量显著性增多（P〈0．05），但对MCAO后12h时的各指标无显著性影响。结论脑梗死早期P13K／Akt信号转导通路的激活以及该通路关键蛋白p-Akt（Ser473）的应激性升高具有脑保护作用，而脑梗死后期该通路活性的衰竭及其关键蛋白的急剧降低则与脑损伤有关。