小檗碱对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的调节作用

目的探讨小檗碱抑制肝癌HepG2细胞增殖及诱导细胞凋亡的作用及可能机制。方法活细胞计数(CCK-8)法检测小檗碱对HepG2细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测小檗碱对细胞凋亡及细胞周期的影响;实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹法(Western blotting)检测抗增殖基因BTG2及细胞周期蛋白CyclinD1的mRNA和蛋白的表达情况。结果小檗碱可以显著抑制肝癌HepG2细胞的增殖,随着小檗碱作用浓度的升高及作用时间的延长,抑制作用增强(P<0.01);小檗碱可使HepG2细胞周期阻滞在G1期,并促进细胞凋亡,凋亡率与小檗碱的作用时间成正比(P<0.05);随着小檗碱作用时间的延长,抗增殖基因BTG2 mRNA的表达增加(P<0.05);细胞周期蛋白CyclinD1 mRNA的表达则逐渐降低(P<0.01)。结论小檗碱能够抑制肝癌HepG2细胞的增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与其上调抗增殖基因BTG2和下调细胞周期蛋白CyclinD1的表达相关。

miR-21对HepG2细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

目的研究miR-21对HepG2细胞增殖和凋亡的影响并探讨其可能的分子机制。方法体外培养HepG2细胞,并将细胞分为增强组、抑制组和对照组,分别给予Lipofectamine 2000和Hsa-miR-21 mimics (50nm/L)、Lipofectamine 2000和Has-miR-21 inhibitor(100 nm/L)转染或者给予Lipofectamine 2000处理干预。采用Western blot法检测B细胞异位基因2(BTG2)蛋白表达,采用CCK-8法检测细胞增殖,使用流式细胞术(FCM)检测细胞周期和凋亡变化。结果增强组细胞BTG2蛋白表达水平最低,抑制组细胞BTG2蛋白表达水平最高,对照组细胞BTG2蛋白表达水平强于增强组而低于抑制组,组间差异比较有统计学意义(P<0.05);抑制组细胞增殖率较增强组和对照组明显降低(P<0.05),增强组较对照组明显增强(P<0.05);与增强组或对照组比,抑制组细胞周期S期明显减少(P<0.05),而G2期则明显增多(P<0.05),与对照组比,增强组S期明显增加,而G2期明显较少(P<0.05);与增强组和对照组比,抑制组细胞凋亡率显著增加(P<0.05),而与对照组比,增强组细胞凋亡率显著减少(P<0.05)。结论 miR-21可能通过直接靶向调控BTG2表达而影响HepG2细胞的生长,可能成为干预肝癌生长的新途径。

携带FLAG标签的人BTG2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建人B细胞易位基因2(BTG2)真核表达载体,并在HeLa细胞中表达携带FLAG标签的BTG2蛋白,为阐明BTG2基因的功能提供实验工具。方法:利用PCR法获得全长BTG2片段,将扩增得到的片段插入真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点;然后按照FLAG序列设计并合成寡核苷酸片段,插入pcDNA3.1(+)-BTG2载体,构建pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2载体;将以上重组质粒转染HeLa细胞,将细胞分为转染pcDNA3.1(+)空载体组、转染pcDNA3.1(+)-BTG2组和转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组,采用抗FLAG抗体的Western blotting法,检测FLAG-BTG2融合蛋白在HeLa细胞中的表达水平。结果:将全长BTG2片段链接于pcDNA3.1(+)质粒,经限制性核酸内切酶BamHⅠ酶切分析及DNA测序证实载体序列准确;该载体转染HeLa细胞后用抗FLAG抗体进行Western blotting法检测,在空载体组和pcDNA3.1(+)-BTG2组HeLa细胞中检测不到FLAG融合蛋白的表达,而在转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组中检测到FLAG-BTG2融合蛋白的表达。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2真核表达载体,并能在HeLa细胞中有效表达携带FLAG标签的BTG2蛋白。

微RNA18与B细胞易位基因2在肝癌细胞中差异表达相关性的研究

目的研究微RNA18（miR18）对肝癌细胞HepG2基因表达谱的影响，预测其靶基因，初步探讨miR-18与抗增殖基因B细胞易位基因2（BTG2）两者在肝癌发生过程中差异表达的相关性。方法利用基因表达谱芯片技术筛选HepG2的微RNA差异表达谱，应用生物信息学方法预测表达明显上调的miR-18的靶基因，初步筛选出直接调控的靶基因为抗增殖基因BTG2；应用RT-PCR和Northernblot法分析BTG2正常与肝癌组织中的表达情况。结果生物信息学分析结果显示miR-18分子调控的下游靶基因有609个，涉及细胞增殖、分化和凋亡、转录调节等众多生理和病理过程；抗增殖基因BTG2在肝癌组织和细胞中呈明显低表达。结论miR-18在肝癌细胞中表达明显上调，并可能负性调控抗增殖基因BTG2在肝癌细胞中的表达，两者共同在肝癌细胞增殖方面发挥着重要作用。

增加B细胞异位基因2蛋白表达抑制结肠癌细胞的增殖与转移

目的通过增加B细胞异位基因2（BTG2）蛋白表达水平的方法，抑制结肠癌细胞的增殖和转移。方法采用Western blot法检测正常人肠上皮细胞HIEC和结肠癌细胞SW620、HT-29、LS174T中BTG2蛋白的表达水平。采用免疫组织化学方法检测40例正常结肠上皮、40例结肠腺瘤和40例结肠癌组织中BTG2蛋白的表达情况。将含BTG2基因全长序列的质粒转染结肠癌SW620细胞，采用四甲基偶氮唑蓝（MTr）法绘制细胞生长曲线，免疫荧光方法检测Ki-67蛋白表达，划痕实验和Transwell双室培养体系检测结肠癌SW620细胞的迁移能力，鼠尾胶Matrigel 3D培养体系检测SW620细胞伪足生长情况。结果Western blot检测结果显示，正常人肠上皮细胞HIEC、结肠癌细胞SW620、HT-29和LS174T中BTG2蛋白相对表达水平分别为0．83±0．12、0．18±0．04、0．20±0．05和0．36±0．07。免疫组织化学方法检测结果显示，BTG2蛋白在正常结肠组织、结肠腺瘤组织和结肠癌组织中的阳性表达率分别为82．5％（33／40）、77．5％（31／40）和17．5％（7／40），组间差异有统计学意义（P〈0．05）。免疫荧光方法检测结果显示，对照组、空载质粒组和BTG2转染组中Ki-67阳性率分别为（76．2±8．0）％、（81．4±9．7）％和（50．1±7．1）％，组间差异有统计学意义（P〈0．05）。划痕实验显示，对照组、空载质粒组和BTG2转染组SW620细胞两侧间的距离分别为（79．27±11．24）μm、（80．65±12．17）μm和（124．77±19．63）μm，组间差异有统计学意义（P〈0．05）。Transwell实验结果显示，对照组、空载质粒组和BTG2转染组SW620细胞的迁移率分别为（78．5±13．1）％、（73．2±12．9）％和（47．4±9．1）％，组间差异有统计学意义（P〈0．05）。经BTG2基因转染的SW620细胞克隆球伪足数量减少，延展性较差。结论BTG2基因参与结肠癌细胞的增殖和转移，有效恢复BTG2蛋白功能，有望成为结肠癌基因治疗的方法选择之一。