转基因大麦B-hordein基因荧光定量PCR方法的建立

为快速定量大麦贮藏蛋白基因B-hordein差异表达,利用SYBR Green I染料法测定转基因大麦和对照花后10 d籽粒B-hordein表达量,通过RT-PCR扩增B-hordein和内参基因actin片段,对PCR退火温度、引物浓度等进行优化,结合扩增曲线和熔解曲线分析。结果表明,转基因大麦B-hordein基因表达量较对照品种Golden Promise显著降低(P<0.05),B-hordein和actin扩增片段分别在(84.51±0.01)℃和(80±0.01)℃处显示特异性单峰,可成功建立转基因大麦B-hordein SYBR Green I实时定量PCR法。

青稞B-hordein基因对小麦面粉加工特性的影响

B组醇溶蛋白是大麦的主要贮藏蛋白之一,其组成及含量与大麦的营养品质和加工品质密切相关。为探究大麦B组醇溶蛋白对小麦面粉加工特性的影响,以转青稞B-hordein基因的小麦转基因高代株系(T4、T5代)及其受体品种龙麦30为材料,分别对转B-hordein基因小麦高代株系及龙麦30进行分子检测、农艺性状测量、近红外分析和粉质分析。结果表明,转B-hordein基因小麦高代植株均为阳性植株;在农艺性状方面,转B-hordein基因小麦与龙麦30无显著差异;在品质方面,转B-hordein基因小麦的蛋白质含量、湿面筋含量的平均值均极显著高于龙麦30;粉质分析结果也表明转B-hordein基因小麦的粉质参数优于龙麦30。由此推测,B-hordein基因的成功转化能够改善小麦的面粉加工特性。

利用RNAi抑制B-hordein合成降低大麦籽粒蛋白质含量

【目的】通过RNAi策略抑制大麦籽粒B-hordein的表达,获得高氮肥水平下籽粒蛋白质含量降低的转基因大麦新种质,探索大麦品质改良新途径。【方法】采用同源PCR技术克隆大麦B-hordein核心保守序列,通过Gateway技术构建大麦B-hordein的RNAi植物表达载体pBract207-zz-gp4,利用农杆菌介导法转化大麦Golden Promise幼胚,获得转基因植株。通过PCR检测、Southern杂交验证RNAi构件在转基因大麦及其后代基因组的整合情况。采用半定量RT-PCR分析转基因大麦花后不同发育时期B-hordein转录表达情况。基于近红外谷物分析仪测定蛋白质含量,并进行醇溶蛋白SDS-PAGE检测,以筛选蛋白质含量降低的转基因大麦株系。开展氮肥运筹相关试验,检验RNAi效率及高氮肥水平下转基因大麦蛋白质含量变化情况。【结果】获得大麦B-hordein片段2条(Gp4和Gp5),测序结果表明该片段大小为349 bp,聚类分析表明该序列跟已知大麦醇溶蛋白基因同源性最高达92%,与该基因已登录的mRNA序列同源性高于98%,确认所得片段为大麦B醇溶蛋白基因片段。利用Gateway技术将Gp4片段正反向插入载体pBract207,反向重复序列用i18和iv2 intron连接,构建了Ubi启动子驱动的大麦B-hordein RNAi植物表达载体pBract207-zz-gp4。通过农杆菌介导转化大麦Golden Promise幼胚,结合目标基因及筛选标记基因的PCR验证,获得含有RNAi构件及筛选标记基因的转基因大麦株系11个。Southern杂交检测表明RNAi构件已经稳定整合到T2/T3转基因大麦基因组。随机选取6个T3转基因大麦株系,半定量RT-PCR结果表明花后不同发育时期转基因大麦籽粒B-hordein表达水平明显低于非转基因对照,20 d时转基因株系表达量不仅相比同期对照降低28.19%—55.19%,而且在各时期中也最低。利用随机选取的T1和T3籽粒进行蛋白质含量测定表明8个转基因大麦株系的蛋白质含量相比非转基因对照显著降低,SDS-PAGE电泳结果显示与非转基因相比,转基因各株系B-醇溶蛋白比率有不同程度降低,其中3个株系B-醇溶蛋白比率降低明显,平均减幅为49.42%。采用蛋白质含量降低的转基因大麦株系RNAi-20开展氮肥运筹试验,结果表明,高氮肥水平HN2及HN3处理,该株系蛋白质含量显著低于非转基因对照;施以等量高氮肥时,伴随氮肥后移(HN2到HN3),该株系总蛋白含量相对非转基因对照逐渐降低。SDS-PAGE电泳结果显示B醇溶蛋白含量降低,电泳带型发生变化。【结论】RNAi技术能抑制籽粒B-hordein表达,降低B-醇溶蛋白含量,高氮肥水平下能显著降低大麦蛋白质含量。

利用RNAi技术沉默大麦B-Hordein基因的研究

为限制大麦籽粒中贮藏蛋白的积累,降低其蛋白质含量,以大麦幼胚为受体材料,采用农杆菌介导的转化方法,将大麦B组醇溶蛋白基因gp4/antisense gp4片段与Ubi启动子相连导入大麦,经PCR检测证实,含有gp4反向重复基因片段的RNAi抑制表达框架已成功转入大麦。RT-PCR结果表明,转基因株系中B-Hordein mRNA积累受到明显抑制。收获T1代籽粒,经近红外谷物分析仪测定表明,2个转基因大麦株系籽粒蛋白质含量(分别为11.4%、11.7%)较对照(12.3%)降低。因此,利用RNA干涉技术降低大麦蛋白质含量是可行的。

青稞B-hordein基因表达载体构建及对小麦的遗传转化

利用从具有特殊B-hordein亚基组成的青藏高原青稞材料中克隆的B-hordein编码基因(SL60)和小麦高分子量谷蛋白亚基胚乳特异表达启动子PGlu1Dx构建了真核表达载体pCB2007-SL60.通过农杆菌介导对普通小麦进行遗传转化,共获得227株再生植株,经PCR鉴定和转化片段测序验证,最终获得5株阳性植株.研究为进一步分析B-hordein基因在小麦背景中的遗传和表达,以及对小麦加工特性的影响奠定了基础.

18个大麦品种醇溶蛋白基因的比对和序列分析

为探究大麦B-醇溶蛋白的生物学特征,对来自美国、墨西哥以及国内不同省份的18份大麦品种的B-醇溶蛋白基因进行了克隆和分析。结果表明:20个包含完整编码区的基因序列,14个为编码基因,6个为假基因;与GenBank注册的45个序列进行对比,各基因之间的相似度为82.9%–99.8%,说明这20个基因序列全部是新基因或新的单元型;14个编码基因的推断氨基酸序列表明,其中13个基因含有8个保守的半胱氨酸残基,只有一个含有7个半胱氨酸残基,这在大麦中是首次发现;基因进化树分析表明,20个B-醇溶蛋白基因中有19个V型,只有一个H型且没有Y型。本研究为促进大麦B-醇溶蛋白基因数据的发表提供了基础,同时也可以为大麦B-醇溶蛋白基因研究提供参考价值。

青稞B组醇溶蛋白基因5′上游调控区的TAIL-PCR克隆及序列分析

为了阐明青稞种子中B组醇溶蛋白合成的遗传调控机制，为分子改良大麦和小麦籽粒品质奠定基础，以青稞品种Z09和Z26的基因组DNA为模板，根据已克隆的青稞B组醇溶蛋白（B-hordein）基因的5’端序列设计三个基因特异的反向引物，分别与随机简并引物配对，进行热不对称嵌套PCR（Thermal asymmetric interlaeed PCR，TAIL-PCR）扩增，从两份西藏青稞材料中分离克隆出2个B-hordein基因的上游调控序列。序列测定结果表明，两个扩增片段长度分别为395和396bp，加上已知B-hordein基因中的GSP2引物序列与翻译起始密码子之间198bp的长度，则可得到约600bp的B-hordein基因5’上游调控序列。将所得序列与Genbank中的三个贮藏蛋白基因的对应区段进行序列比对，所得序列与来自野生智利大麦（H．chil-ense）的B3-hordein基因（Genbank登录号：AY998010）、普通小麦（T.aestivum）的低分子量麦谷蛋白亚基基因（Genbank登录号：X07747）和栽培大麦（H．vulgare）的B-hordein基因（Genbank登录号：X03103）具有81％～95％的序列相似性。推测其TATAbox位于-80bp，CAAT-likebox位于-140bp处。另外，在-300bp处存在一个胚乳盒（EndospermBox，EB），包含EM基序和GCN4基序。EM基序高度保守，GCN4基序有一个核苷酸位点的突变。此外，在约-560bp处存在一个胚乳盒类似结构。

青藏高原青稞B组醇溶蛋白遗传多样性研究

报道了青藏高原青稞B组醇溶蛋白的遗传多样性.在66份青藏高原青稞材料中,共有15种不同条带、29种不同条带组合,表明青藏高原青稞材料具有丰富的多态性.不同来源的群体材料间遗传多态性存在差异,西藏育成品种的多态性略低于四川农家品种,人工选择使其遗传多态性减弱.聚类分析将材料分成3组,材料聚类与材料来源地没有明显的相关性.

西藏青稞4个B组醇溶蛋白基因的克隆和特征(英文)

从两份西藏青稞材料中分离克隆出4个B组醇溶蛋白基因(BH1-BH4),DNA测序结果表明:它们均包含完整的开放阅读框。推断的氨基酸序列与先前报道的大麦B组醇溶蛋白具有相同的蛋白质基本结构。系统分析表明:它们推断的氨基酸序列与栽培大麦中的B组醇溶蛋白具有较高的相关性,与野生大麦和山羊草属的醇溶谷蛋白相似性较低。并且,在4个基因BH1-BH4中,BH1与先前报道的B组醇溶蛋白基因有较低的序列相似性,因此我们对BH1基因进行了原核表达,含该基因的表达载体在大肠杆菌中表达出相对分子质量为28．15 kDa．并以包涵体形式存在的蛋白,进一步对其在青稞谷粒品质改良中的潜在价值进行了探讨。

不同大麦品种B-醇溶蛋白基因的克隆和序列分析

大麦醇溶蛋白是影响大麦食品加工、麦芽制备和饲用价值的主要因素之一。B-醇溶蛋白占总醇溶蛋白的70%~80%,对品质的贡献相对较大。本研究对来自不同国家和地区的18份大麦材料的B-醇溶蛋白基因进行了克隆和鉴定,共得到27个完整的基因序列,包括22个编码基因和5个假基因。经与GenBank注册的序列进行比对,它们之间的碱基相似度为79.6%~99.5%,说明这27个基因序列全部是新基因或等位变异。22个基因的推断氨基酸序列表明,其中18个基因含有8个保守的半胱氨酸残基,2个基因含有7个半胱氨酸,其余2个则含有9个半胱氨酸,这在大麦中是首次发现,其可能属于编码优质蛋白亚基的基因。研究结果将为进一步研究大麦醇溶基因的特征特性以及培育优质大麦品种提供理论参考。