简单可行的EB病毒转化B淋巴细胞方法的探讨

介绍两种简便可行的EB病毒转化B淋巴细胞的方法，即微量全血法和冻存全血法。与环孢霉素A法相比较，这两种方法具有操作简单，所需血样少，无需环孢霉素A等优点。这些特点尤其是在进行大量样本转化时显得更为突出。用微量全血法和冻存全血法共进行79例转化试验，转化成功率分别为46％与85％。对于影响这两种EB病毒转化结果的因素也进行了讨论。

瘢痕疙瘩家系永生淋巴细胞株的建立及其染色体分析

目的建立瘢痕疙瘩家系永生淋巴细胞株,并对该细胞株进行染色体核型分析,探讨用这种方法建立瘢痕疙瘩永生细胞库的可行性和可靠性。方法采用EB病毒转化技术,把瘢痕疙瘩家系外周血B淋巴细胞转化成永生化淋巴母细胞系(LCL)。分别对建株前和建株后10、20、30、35代的细胞株进行染色体核型分析。结果成功地对瘢痕疙瘩家系27个个体建立了永生细胞株,建株后10代、20代的细胞株染色体未发现明显异常;而培养30代、35代的细胞株染色体发生数目和结构的异常。结论瘢痕疙瘩家系永生淋巴细胞株可以为以后的研究提供随时可取的实验材料,在用做遗传学分析时宜在转化早期进行。

乙型肝炎病毒感染者B淋巴母细胞系的建立

目的在体外建立HBV感染者永生化的B淋巴母细胞系(LCL),并鉴定其HLA-A基因亚型。方法利用EB病毒转化外周血B淋巴细胞使之永生化,用环胞菌素A(Cys A)抑制血液中T淋巴细胞的活性;用PCR-SSP法检测血样本的HLA-A基因亚型。结果成功建立了HBV感染者的永生细胞株16株,其中急性乙肝4例,慢性乙肝10例,携带者2例。所有的细胞株冻存后复苏的成功率为100%。细胞株的HLA-A基因亚型包括1101、0201、0101、2403等。结论转化后的LCL保持了良好的稳定性,既可能作为人源单抗的来源,也可作为体外研究HBV特异性免疫应答的刺激细胞和靶细胞。永生化细胞HLA-A基因亚型的鉴定有可能使其成为异体相应亚型体外特异性免疫应答的刺激细胞和靶细胞。

乙型肝炎患者EBV转化B淋巴母细胞系的建立及其特点

为研究乙型肝炎患者EBV转化的B淋巴母细胞系的特征 ,并为进一步研究乙型肝炎患者细胞免疫功能奠定基础。采用丁酸钠诱导B95 8细胞产生高滴度EBV ,并感染A(ATL比正常升高 2倍 )、B(ATL正常 )两组乙型肝炎患者外周血单个核细胞。结果表明 ,EBV感染后 4～ 8周 ,建立了 19例乙型肝炎患者的永生化B淋巴母细胞系 ,A组患者的B细胞形成集落的时间明显晚于B组 2～ 3周 ;细胞系冻存复苏后 ,活性良好 :分别有 88 34%和 37 48%的永生化B细胞膜上表达CD19和CD2 0 ;永生化的B细胞中检测不到HBVDNA。提示乙型肝炎患者永生化B淋巴母细胞系的建立时间与患者免疫状态有关 ;B细胞永生化后 ,HBVDNA不能在细胞内持续存在 。

肾综合征出血热患者B淋巴母细胞系的建立方法及意义

目的 :探讨EB病毒 (EBV)转化B淋巴细胞的最佳方法 ,为进一步研究肾综合征出血热 (HFRS)患者的细胞免疫功能奠定基础。 方法 :采用环孢素A(CsA)法、微量全血法和冻存全血法三种方法建立B淋巴母细胞样细胞系 (B LCL) ,比较建立细胞系成功率和所用时间。 结果 :EBV成功转化后的B LCL ,其体积增大并永生化 ,进而增生的淋巴细胞积聚成团。CsA法、微量全血法和冻存全血法转化的成功率分别为 73.3%、2 6 .7%和 4 6 .7%。 结论 :CsA法成功率高 ,建立细胞系所用时间短 ,是建立B LCL的最佳选择。

肾综合征出血热患者永生化B淋巴母细胞系的建立

目的 建立肾综合征出血热患者永生化的B淋巴母细胞系 ,为进一步研究汉滩病毒感染者的细胞免疫功能奠定基础。方法 自HFRS患者血液中分离外周血单个核细胞 (PBMC) ,再用EB病毒感染PBMC ,同时加入环胞素A(CysA)。 结果 2 0例血样标本经EBV感染 4周左右 ,形成了 15例永生化B淋巴母细胞系。成功转化后的B淋巴母细胞系 ,其体积增大 ,进而增殖的淋巴细胞积聚成团。结论 永生化的B淋巴母细胞系可传代培养。冻存复苏后细胞增殖活性并无改变。

遗传眼病永生化细胞系建立方法

目的通过遗传眼病患者的外周血或皮肤组织建立永生化细胞系,以保存其遗传资源。方法永生化B淋巴细胞系的建立:抽取患者静脉血,分离淋巴细胞,以EB病毒体外转化B淋巴细胞为类淋巴母细胞,利用环孢霉素A抑制T淋巴细胞RNA聚合酶Ⅱ活性,防止已转化B淋巴细胞因受到T淋巴细胞的攻击而退化,培养后建立永生化B淋巴细胞系;皮肤成纤维细胞原代培养:利用DispaseⅡ酶处理离体皮肤组织以分离表皮组织,将其余组织剪碎后贴瓶培养,成纤维细胞可从组织块爬出,生长成为细胞系。结果永生化B淋巴细胞系:共完成标本17例,成功建系15例,成功率88.2%;经过转化后B淋巴细胞悬浮生长,胞浆丰富、形态各异,聚集成团,可无限传代用于实验研究。皮肤成纤维细胞原代培养:共完成标本5例,成功建系3例,成功率60.0%;皮肤成纤维细胞贴壁生长,呈典型纺锤形,中间饱满,两边细长,50代以内增殖旺盛可用于实验研究。结论通过遗传眼病患者的外周血和皮肤组织可建立永生化B淋巴细胞系和皮肤成纤维细胞系以保存其全部遗传信息,为进一步研究相关遗传性眼病奠定物质基础。

HFRS患者汉滩病毒特异性CTL克隆靶细胞的建立及意义

目的 :建立肾综合征出血热 (HFRS)患者汉滩病毒(HTNV)核衣壳蛋白 (NP)特异性CTL克隆的靶细胞 .方法 :采用Ficoll密度梯度离心法分离HFRS患者外周血单个核细胞(PBMC) ,并用EB病毒 (EBV)转化B淋巴细胞 ,建立B淋巴母细胞样细胞系 (B LCL) .然后 ,用含HTNVS基因的重组痘苗病毒 (rVV)转染B LCL ,间接免疫荧光 (IFA)检测NP的表达 ,并用HTNV特异性T细胞克隆对转染rVV的B LCL进行细胞毒杀伤实验 .结果 :B淋巴细胞经EBV感染 4wk左右 ,可形成B LCL .HTNV S基因在B LCL中能有效表达NP ,且能被HTNV特异性T细胞克隆识别 .结论 :成功建立了HFRS患者永生化B LCL .含HTNVS的基因重组痘苗病毒转染的B

CD3单抗联合EBV建立人B淋巴母细胞株的方法研究

目的采用国产的CD3单克隆抗体代替环胞菌素A,建立人淋巴母细胞株(LCL)。方法采静脉血用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞,分别应用CD3单克隆抗体以及环胞菌素A作为免疫抑制剂,对比LCL建株情况。结果CD3单抗组经过4周的培养CD3+细胞由培养前的59.65%减低到52.78%,而环胞菌素A组升高至61.15%(P>0.05);对CD19+细胞的促进作用由培养前的5.39%提高到12.70%,而环胞菌素A为8.47%,两者的差异有显著性意义(P<0.01)。结论CD3单克隆抗体与环胞菌素A同样能够促进B淋巴样细胞株生成,防止体外B细胞的退化。

EB病毒转化的人B淋巴母细胞低密度培养条件的研究

肾综合征出血热(HFRS)患者外周血单个核细胞(PBMC)经 EB 病毒转化为人 B 淋巴母细胞,其培养上清中含 IgM 和 IgG,部分为人抗 HFRS 病毒 IgM 和 IgG。采用含有高浓度白细胞介素6(IL-6)的人纤维母细胞系 CRL1506条件培养液(CM)及^(60)Co 照射 CRL1506饲养细胞对低密度培养的人 B 淋巴母细胞生长、抗体分泌有明显促进作用,并获得单个 B 淋巴母细胞克隆化成功,克隆化后人 B 淋巴母细胞系仍持续分泌抗体。本研究对于克服人单克隆抗体技术中人 B 淋巴母细胞克隆化难、抗体产量低、难于获得特异性单克隆抗体等困难有一定应用价值。

瘢痕疙瘩家系外周血淋巴细胞永生化方法探讨

目的探讨建立瘢痕疙瘩家系永生化细胞库的方法,为研究瘢痕疙瘩的发病机制、诊断和治疗提供长期的标本来源。方法采用EB病毒转化技术,分别采用新鲜血法和冻存血法,将瘢痕疙瘩家系外周血B淋巴细胞转化成永生化淋巴母细胞系。结果成功建立了一瘢痕疙瘩家系中27个个体的永生细胞株:新鲜血法较冻存血法可明显提高一次建系成功率。结论 EB病毒转化技术可有效保存原来个体完整的基因组,为以后的相关研究提供了长期的DNA资源。新鲜血法明显优于冻存血法,更适用于永生化细胞库的建立。

EB病毒转化的B淋巴细胞染色体制备及核型分析

目的 本文通过对 4个EB病毒转化的B淋巴细胞株的染色体核型进行分析 ,探讨以这种方法建立的B淋巴细胞株作为细胞遗传学研究材料的可行性。方法 EB病毒转化的B淋巴细胞株用含 2 0 %胎牛血清的RPMI - 16 4 0培养液传代培养。选择细胞分裂旺盛期 ,调整细胞浓度为 2～ 4× 10 6/ml时 ,加入秋水仙碱 37℃处理 2～ 3h ,常规收获细胞 ,气干法制片 ,GTG法显带。显微镜下计数分析 30～ 5 0个中期分裂相 ,显微照相分析 5个中期分裂相。结果 发现 4个B淋巴细胞株都存在染色体异常。染色体结构发生了复杂易位 ,产生了衍生染色体。亚二倍体分裂相增加 ,四倍体分裂相明显增多 ,甚至出现了八倍体分裂相 ,但均未见到染色体有规律性的异常。结论 表明EB病毒的基因组已整合到B淋巴细胞的染色体上 ,并造成B淋巴细胞染色体组的损伤。建议在用EB病毒转化B淋巴细胞建株做细胞遗传学研究时应慎重。

应用微量冻存法建立EB病毒转化脐带血淋巴母细胞系

目的应用微量冻存法建立EB病毒(EBV)转化脐带血淋巴母细胞系(LCLs),为永久保存具遗传疾病的脐带血资源提供研究基础。方法知情同意下收集妊娠中期至晚期终止妊娠的20例孕妇脐带血样本,采用微量冻存法,通过EBV转化获得脐带血LCLs,冻存复苏后,染色体G显带分析,检测建系前后的核型稳定性。结果 20例样本中19例成功进行微量冻存法转化,成功率95%,转化成功的脐带血LCLs冻存后复苏成功率达100%。除1例因胎儿为水肿胎失败外,19例脐带血样本均可在10 d左右观察到淋巴细胞增大呈母细胞化,增殖的淋巴母细胞凝聚成团,6~8周后可获得稳定生长的脐带血LCLs,转化前后的淋巴细胞染色体核型无明显差异。结论应用微量冻存法可成功建立脐带血LCLs,EB病毒转化的脐带血LCLs细胞遗传学特性稳定,可用于进一步的遗传学研究。

具染色体不稳定特点的B淋巴母细胞株BCHI-1的建立

经微量全血EB病毒转化法建立了一具染色体不稳定特点的B淋巴母细胞株(BCHI-1),该细胞株呈悬浮生长,核型为2n=46,XX。细胞群体倍增时间为52h。该细胞株表现为姐妹染色单体交换增高(16.88个/细胞),染色体畸变为4.5％,微核率25‰。该细胞株自发和丝裂霉素C诱发的染色体不稳性与正常的细胞株JMS95031相比均具有显著性差异(P<0.01)。

原发性免疫缺陷病患者B淋巴母细胞系的建立及其核型检测

目的体外建立原发性免疫缺陷病(PIDD)患者永生化B淋巴母细胞系(B-LCL),为进一步开展PIDD相关研究提供资源。方法自PIDD患者外周血中分离单个核细胞,采用EB病毒感染并加入环胞菌素A抑制T淋巴细胞活性的方法建立B-LCL,7 d左右倒置显微镜下观察转化细胞的形态,并进行染色体核型分析。结果转化后的B淋巴母细胞体积增大,增生的淋巴细胞多聚集成团;已建立的永生化细胞能够成功冻存、复苏及传代;转化前后细胞染色体核型无明显改变。结论本实验成功建立了PIDD患者永生化的B-LCL,为进一步开展PIDD的病因学研究及诊断、治疗奠定了基础。

应用人脐带血单个核细胞体外同时表达EB病毒和巨细胞病毒蛋白抗原

目的：拟建立一种能预防和治疗移植后病毒感染的抗原呈递细胞（ antigen presenting cell,APC）。方法：利用人的脐带血单个核细胞（ CB derived mononuclear cells, CBMC），用 EB病毒 (Epstein Barr virus, EBV)感染转化成 B淋巴母细胞细胞系（ B lymphoblastoid cell lines, BLCL），再用编码有 CMV.pp65蛋白基因的逆转录病毒转染，最后经 Western blot和免疫组化检测，证实该株细胞同时表达 EBV和巨细胞病毒 (cytomegalovirus, CMV)特异性蛋白。结果：获得了能同时表达 EBV和 CMV特异性蛋白的细胞株。结论：上述方法可以建立能同时表达 EBV和 CMV特异性蛋白抗原的细胞系。

CpG基序联合EB病毒建立永生化B淋巴母细胞系

目的体外建立慢性乙型肝炎患者永生化的B淋巴母细胞系(LCLs)。方法用EB病毒感染自慢性乙型肝炎患者外周血中分离的单个核细胞(PBMC),加入CpG DNA免疫调节基序以诱导B淋巴细胞增殖,环胞菌素A(CysA)抑制T淋巴细胞的活性。光学显微镜下观察LCLs的形态特征,利用流式细胞术分析LCLs膜表面分子CD19和CD23的表达水平。结果46例患者PBMC经EBV感染4周后,42例转化成永生化B淋巴母细胞系,成功率为91.3%。转化后的B淋巴母细胞体积增大积聚成团,可进一步分裂增殖并长期传代培养。结论CpG免疫调节基序联合EBV感染人PBMC,提高转化效率,转化后的LCL保持了成熟B淋巴细胞的生物学特性,可作为体外研究HBV特异性免疫应答的刺激细胞和靶细胞。

新疆和田维吾尔族长寿老人永生细胞株的建立

目的通过用EB病毒转化外周血B淋巴细胞使之成为永生细胞株的方法,建立新疆和田维吾尔族长寿老人永生细胞株,为永久保存新疆长寿老人的基因遗传资源及后续研究奠定基础。方法常规制备EB病毒上清,用环孢素法和冻存全血法转化外周血B淋巴细胞。结果以环孢素法成功建立了5株新疆和田维吾尔族长寿老人永生细胞,其中百岁2人,90～99岁3人,建系成功率为100%(5/5),以冻存全血法建系成功1例(1/5)。HLA基因分型结果在建系前后完全一致。结论与冻存全血法相比,环孢素法能更有效地转化长寿老人永生细胞株,可为长寿的分子遗传机制研究以及某些细胞生物学性状的检测提供充足的实验材料。

rhTNF-α对TB-LCL趋化作用的研究

目的研究重组人TNF-α(recomb inant hum an tumor necrosis factor-,αrhTNF-α)对扁桃体B原淋巴细胞(tonsil B lymphob lastoid cellline,TB-LCL)的趋化作用,建立一个模型以研究细胞因子与B细胞相互间的作用。方法用EB病毒(Epste in-Bar virus,EBV)转化扁桃体B细胞建立TB-LCL系,以小室法研究rhTNF-α)对TB-LCL的趋化作用。结果rhTNF-α对TB-LCL有明显趋化作用,并呈剂量依赖关系。这种作用能为抗TNF-α的单抗E6所阻断。结论以上为研究细胞与细胞因子间的相互作用提供了有用而简便的模型。

含HTNV S基因重组痘苗病毒在HFRS患者B淋巴母细胞系中的表达

采用Ficoll密度梯度离心法(淋巴细胞分离液)分离肾综合征出血热(HFRS)患者外周血单个核细胞(PBMC),并用EB病毒(EBV)感染B淋巴细胞,建立永生化的B淋巴母细胞系(B-LCL)。然后,用含汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)S基因的重组痘苗病毒感染B-LCL,应用间接免疫荧光检测核衣壳蛋白的表达。结果表明,B淋巴细胞经EBV感染4周左右,可形成永生化B-LCL。成功转化后的B-LCL,体积增大,且增殖的淋巴细胞积聚成团。汉滩病毒S基因在B-LCL中能有效表达核衣壳蛋白。含S基因的重组痘苗病毒感染的B-LCL可用作HTNV核衣壳蛋白特异性CTL活性研究的靶细胞。