利用荧光定量PCR检测B.ovis侵染巨噬细胞RAW264.7的相对数量

为了探讨布鲁氏菌胞内寄生的机制,采用荧光定量PCR方法对进入巨噬细胞的布鲁氏菌的数量进行检测,克隆了绵羊种布鲁氏菌019株的16SrRNA基因和小鼠巨噬细胞RAW264.7的GAPDH基因。以16SrRNA基因和巨噬细胞GAPDH做为内参基因,将二者的比值作为检测布鲁氏菌进入巨噬细胞数量多少的指标,建立绵羊种布鲁氏菌019株侵染巨噬细胞不同阶段的感染模式。结果表明:在绵羊种布鲁氏菌019株侵染巨噬细胞15min～1h,16SrRNA与GAPDH的比值缓慢上升,侵染1～4h中,16SrRNA与GAPDH的比值急剧上升,说明在此阶段,细菌侵入细胞中的数量显著增多。

B．ovis的血清学诊断

Ｂ．ｏｖｉｓ的血清学诊断刘志文，程风涛关于Ｂ．ｏｖｉｓ的血清学诊断１０多年来我们做了一些工作［１］，早期我们用６３／２９０标准菌制备抗原近年来改用０ｌ９号菌，每年提取二批抗原以相同标化方法标定并应用于现场和试验室的血清学诊断。本年度再度对上述制剂进行...

B．ovis死菌制剂佐剂苗免疫后的碱性磷酸酶试验检查

本文报告由试验室制备的Ｂ．ｏｖｉｓ死菌制剂佐剂苗接种了良种细毛羊后的碱性磷酸酶（ＡＩＰ）试验观察。试验分为３个组，即Ｂ．ｏｖｉｓ死菌制剂佐剂苗免疫组．Ｂ．ｏｖｉｓ死菌制剂佐剂苗免疫攻毒组，感染对照组。向时进行了不免疫的正常对照检查。结果看到介体液免疫阳转情况下，免疫组的ＡＩＰ平均阳性检出率３０ｄ为４８％，积分９２；７５ｄ为４５％，积分１１６；１６５ｄ为４２％，积分１１８。免疫攻毒组３０天、７５天分别是４５％，积分１０５；４０％，积分１１８。而感染对照组３０ｄ、７５ｄ、１６５ｄ分别是８８％，积分２８７；９４％，积分３１６和１００％，积分３６７。而正常动物对照则是２２％，积分４３。试验显示感染对照较免疫组、免疫攻毒组和正常对照动物有非常显著的差异。试验的成功提示出ＡＩＰ的检查可以用来对Ｂ．ｏｖｉｓ感染进行评价，可作为辅助临床诊断方法。

B．ovis死菌制剂苗接种后的过氧化物酶试验检查

本文报告了死菌制剂佐剂苗免疫后的过氧化物酶（Ｐｏｘ）检查试验，结果显示免疫组在注苗后３０天、７５天、１６５天Ｐｏｘ染色阳性率分别是９２％、９６％、１００％，积分是２８９、３１７、３３７。感染对照组是２５％、２５％、３３％，积分是３８、３１．４、３３．３。免疫攻毒组分别是８０％、８５％，积分为２３０、２４０。这两个试验组和对照组存在着非常显著差异（Ｐ＜０．０１）。作者认为Ｐｏｘ试验可能是一个有用的免疫学指标，在反映抗体对Ｂｒ．ｏｖｉｓ的免疫状态方面可加以利用。

细菌学方法和HOOF-Prints技术在绵羊种布鲁氏菌019株鉴定中的比较研究

应用细菌学常规方法和分子生物学检测方法对绵羊种布鲁氏菌非典型株019进行分类研究。利用高变8聚核苷酸DNA指纹技术(HOOF-Prints)对绵羊种布鲁氏菌019株可变数目重复片段(VNTR)的8个位点进行PCR扩增和序列测定,将测定结果与GenBank数据库比较分析,应用DNAMAN进行同源性分析,并构建系统进化树。结果表明,绵羊种布鲁氏菌019株和绵羊种布鲁氏菌参考株63/290的亲缘关系高于绵羊种布鲁氏菌019株与其他参考株的亲缘关系,该结论与细菌学常规鉴定结果一致。应用HOOF-Prints技术可以对绵羊种布鲁氏菌非典型株019进行鉴定,该技术有望弥补传统分类方法的不足。

绵羊种布鲁氏菌019株侵染绵羊巨噬细胞cDNA文库的构建

目的构建绵羊种布鲁氏菌019株侵染绵羊肺泡巨噬细胞的cDNA文库。培养绵羊肺泡巨噬细胞,用绵羊种布鲁氏菌019株侵染绵羊巨噬细胞,用试剂盒构建侵染后绵羊肺泡巨噬细胞的cDNA文库,并对文库中的部分克隆进行测序。结果表明,构建的绵羊种布鲁氏菌019株侵染绵羊巨噬细胞cDNA文库达到建库要求;所测序列与牛的基因组编码序列同源性最高。在绵羊种布鲁氏菌019株侵染绵羊肺泡巨噬细胞过程中,以50∶1(细菌∶细胞)的个数比,侵染3.5h,能有效构建侵染后绵羊肺泡巨噬细胞的cDNA文库。

山羊无浆体MSP4全长基因的克隆测序与B细胞抗原表位预测

该试验对重庆忠县感染山羊的无浆体主要表面蛋白4(MSP4)基因进行克隆测序,并对其系统进化、基因型以及推导蛋白的B细胞抗原表位进行分析.结果表明:所克隆的MSP4基因片段大小为870bp,CDS序列全长852bp,编码283个氨基酸,GenBank登录号为HQ840746.该序列与已公布的羊无浆体MSP4(AY702923,HQ456347,HQ661165)同源性最高,均达99.8%.系统发育分析发现,该序列被聚类到羊无浆体群.抗原表位预测表明忠县山羊无浆体MSP4蛋白的优势B细胞抗原表位在N端第77-82(AGTALS),93-98(APSLSG),216-220(TAGLV)和244-249(GSTLAI)4个区段.本研究从分子水平证实重庆存在羊无浆体感染,我国羊无浆体至少有5个基因型,重庆山羊无浆体MSP4蛋白具有4个优势B细胞抗原表位,为羊无浆体病亚单位疫苗的研发提供了参考.

绵羊附睾种布鲁氏菌019株外膜蛋白基因序列比较研究

目的证实新疆分离绵羊附睾种布鲁氏菌019株与参考菌株的差异性。方法采用PCR扩增绵羊附睾种布鲁氏菌019株外膜蛋白的Omp31、Omp25、Omp22、Omp2a、Omp2b基因,并进行序列比较分析。结果绵羊附睾种布鲁氏菌019株的5种外膜蛋白基因序列与绵羊种布鲁氏菌参考株在核苷酸水平和氨基酸水平上均存在差异。结论绵羊附睾种布鲁氏菌019株是独特的新疆地方株。

羊毛尾线虫凉山州分离株的线粒体cox1和Cyt b基因的序列测定及种系发育分析

应用PCR技术对分离自四川省凉山州12个山羊源羊毛尾线虫分离株的线粒体cox1基因部分序列(pcox1)和Cyt b基因部分序列(pCyt b)进行扩增和分析。结果显示,所获得的羊毛尾线虫pcox1和pCyt b序列长度分别为843bp和909bp,种内变异分别为0.0%~0.5%(7个变异位点)和0.0%~0.1%(1个变异位点),分别检测到7个单倍型和2个单倍型,平均单倍型多样性分别为0.773和0.409,核苷酸多样性分别为0.001 74和0.000 45。构建的种系发育树均显示,12个山羊源羊毛尾线虫凉山州分离株聚在同一小分支,能与其他毛尾线虫相鉴别;不同宿主来源的羊毛尾线虫中国株均聚在同一分支,而羊毛尾线虫西班牙株单独聚为一支,推测不同地方羊毛尾线虫分离株可能存在隐藏种或不同的基因型。结果表明,羊毛尾线虫cox1和Cyt b基因序列种内变异小,种间差异较大,故可作为分子标记用于羊毛尾线虫的种间鉴定;羊毛尾线虫凉山州分离株存在一定的遗传变异和遗传多样性,且cox1基因的多样性水平高于Cyt b基因。本研究结果为羊毛尾线虫的分子分类、群体遗传结构和分子流行病学调查等的进一步研究奠定基础。

基于cytb基因分析帕米尔盘羊和新疆地方家绵羊的系统发育

[目的]研究帕米尔盘羊对新疆地方家绵羊是否有遗传贡献。[方法]测定了盘羊、家绵羊75个体的细胞色素b基因全序列,分析其遗传多样性,计算不同群体间遗传距离,进而构建系统发生树。[结果]新疆地方绵羊中检测到43个多态位点,定义为23个单倍型,单倍型多样度(Hd)为0.889±0.00102,核苷酸多样度(Pi)为0.521%。新疆地方家绵羊群体可分为4个支系(A、B、C和D),其中支系D首次在新疆多浪羊群体中被检测到。[结论]系统发育分析表明,新疆绵羊有多个母系起源或经过多次驯化,摩弗伦羊是绵羊母系祖先之一。