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基于颗粒酶B启动子的磁共振报告基因成像监测CAR-T细胞激活状态
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作者 倪晓英 秦勇 +5 位作者 贺小娅 黄杰 张湘敏 祝慧如 胡倩 蔡金华 《陆军军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第17期1959-1968,共10页
目的利用颗粒酶B(granzyme B,GB)启动子控制铁蛋白(ferritin heavy chain,FTH1)报告基因表达,探讨通过磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)监测嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T细胞)激活状态的可行... 目的利用颗粒酶B(granzyme B,GB)启动子控制铁蛋白(ferritin heavy chain,FTH1)报告基因表达,探讨通过磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)监测嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T细胞)激活状态的可行性。方法通过Ficoll密度梯度离心法以及流式分选得到细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)。将GB启动子和FTH1基因连接,连同二唾液酸神经节苷脂(disialoganglioside 2,GD2)嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)以慢病毒为载体转入CTLs,构建GD2-CAR-T/pGB-FTH1细胞,以GD2-CAR-T/pCMV-FTH1、GD2-CAR-T和T细胞为对照。CytoTox96@非放射性细胞毒性检测各组细胞与人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)共培养后的杀伤效果,ELISA检测共孵育因子以及GB分泌量,Western blot、普鲁士蓝染色、细胞MRI检测共培养后FTH1基因的表达。结果成功获得CTLs并构建GD2-CAR-T/pGB-FTH1、GD2-CAR-T/pCMV-FTH1、GD2-CAR-T细胞,3组细胞对肿瘤细胞杀伤效果、共孵育因子以及GB分泌量均显著高于T细胞组,GB表达水平在与SK-N-SH细胞共培养后1 d最高,3 d和7 d依次降低。GD2-CAR-T/pGB-FTH1组FTH1相对表达量以及铁含量变化趋势与GB表达一致,MRI信号呈逐渐升高趋势。GD2-CAR-T/pCMV-FTH1组FTH1相对表达量、铁含量及MRI信号在各时间点均无显著差异。GD2-CAR-T和T细胞组无明显FTH1表达及聚铁效应。结论基于GB启动子的MRI报告基因成像可实时反映CAR-T细胞的GB表达水平和肿瘤杀伤作用,为CAR-T治疗提供了一种监测细胞激活状态的可视化手段。 展开更多
关键词 颗粒酶b 铁蛋白 报告基因 磁共振成像 嵌合抗原受体t细胞 二唾液酸神经节苷脂
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基于lncRNA PVT1表达分析银杏内酯B对ITP患者B淋巴细胞及Treg/Th17免疫失衡的影响
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作者 雷蕊 杨亚丽 +2 位作者 张宝君 张丙寅 王金龙 《检验医学与临床》 CAS 2024年第21期3157-3160,3167,共5页
目的探讨银杏内酯B对原发性免疫血小板减少症(ITP)患者长链非编码RNA浆细胞瘤转化迁移基因1(lncRNA PVT1)、B淋巴细胞和调节性T淋巴细胞/辅助性T淋巴细胞17(Treg/Th17)免疫失衡的影响及其相关性。方法依据双盲法将2021年5月至2023年5月... 目的探讨银杏内酯B对原发性免疫血小板减少症(ITP)患者长链非编码RNA浆细胞瘤转化迁移基因1(lncRNA PVT1)、B淋巴细胞和调节性T淋巴细胞/辅助性T淋巴细胞17(Treg/Th17)免疫失衡的影响及其相关性。方法依据双盲法将2021年5月至2023年5月廊坊市中医医院收治的130例ITP患者分为对照组(65例)和观察组(65例)。对照组给予长春地辛治疗,观察组给予银杏内酯B治疗,两组均治疗4周。比较两组患者临床疗效;比较两组患者治疗前后lncRNA PVT1表达、B淋巴细胞亚群[CD19^(+)、B1淋巴细胞]比例、Treg/Th17免疫失衡细胞因子[白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-21(IL-21)];分析lncRNA PVT1表达与CD19^(+)、B1淋巴细胞比例以及IL-17、IL-21水平的相关性。结果研究过程中对照组失访7例,观察组失访5例,最终分组为对照组58例,观察组60例。治疗后两组患者lncRNA PVT1表达、IL-17、IL-21水平以及CD19^(+)、B1淋巴细胞比例较治疗前均有所降低(P<0.05),观察组治疗后lncRNA PVT1表达、IL-17、IL-21水平以及CD19^(+)、B1淋巴细胞比例明显低于对照组(P<0.05)。与对照组相比,观察组临床疗效更优(P<0.05)。lncRNA PVT1表达与CD19^(+)、B1淋巴细胞、IL-17、IL-21水平均呈正相关(P<0.05)。结论银杏内酯B对ITP患者具有较高临床疗效,可以显著改善其lncRNA PVT1表达、B淋巴细胞比例、Treg/Th17免疫失衡细胞因子水平,值得临床推广。 展开更多
关键词 长链非编码RNA浆细胞瘤转化迁移基因1 银杏内酯b 原发性免疫血小板减少症 b淋巴细胞 调节性t淋巴细胞 辅助性t淋巴细胞
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基于BCMA突变体构建BCMA CAR-T细胞体外杀伤功能评价模型
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作者 张小雪 华静涵 +3 位作者 侯睿 刘丹 施明 曹江 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期493-500,共8页
目的:为解决野生型B细胞成熟抗原(BCMA)被γ分泌酶切割导致表达不稳定的问题,构建抵抗γ分泌酶切割的BCMA突变体并构建靶细胞,用于评价BCMA CAR-T细胞的杀伤功能。方法:将野生型BCMA的穿膜域替换为人CD8α穿膜域,构建抵抗γ分泌酶切割的... 目的:为解决野生型B细胞成熟抗原(BCMA)被γ分泌酶切割导致表达不稳定的问题,构建抵抗γ分泌酶切割的BCMA突变体并构建靶细胞,用于评价BCMA CAR-T细胞的杀伤功能。方法:将野生型BCMA的穿膜域替换为人CD8α穿膜域,构建抵抗γ分泌酶切割的BCMA突变体(BCMA-CD8αTM),构建过表达该突变体的U266(U266^(BCMA Mut))、K562(K562^(BCMA Mut))、SKOV3(SKOV3^(BCMA Mut))和CHO(CHO^(BCMA Mut))细胞;构建装载NFAT-EGFP报告基因的BCMA CAR Jurkat细胞(BCMA-CAR-Jurkat-Reporter)与U266^(BCMA Mut)细胞共培养,采用FCM检测该细胞中EGFP表达水平以指示NFAT激活水平,荧光素酶法检测BCMA CAR-T细胞对Luciferase标记的K562^(BCMA Mut)细胞的杀伤作用,实时无标记动态细胞分析技术(RTCA)检测BCMA CAR-T细胞对SKOV3^(BCMA Mut)和CHO^(BCMA Mut)细胞的杀伤作用。结果:应用γ分泌酶抑制剂LY411575抑制γ分泌酶活性,显著增强野生型U266细胞表面BCMA表达水平,平均荧光强度上调10倍以上;但撤除抑制剂后BCMA表达水平逐渐降低(P<0.01);BCMA-CD8αTM突变体可抵抗γ分泌酶的切割作用,在U266细胞表面稳定表达(P>0.05);U266细胞及过表达BCMA-CD8αTM的U266细胞与BCMA-CAR-Jurkat-Reporter细胞共培养后都可激活Reporter系统、增强EGFP表达,但该效应在BCMA-CD8αTM过表达的U266细胞中更显著(P<0.01);BCMA-CD8αTM在BCMA表达阴性的K562、SKOV3和CHO 3种靶细胞中成功过表达,且在LY411575处理下该突变体的表达水平仅有小幅度升高;荧光素酶法检测结果显示,不同效靶比下,BCMA CAR-T细胞均可特异、高效杀伤过表达BCMA-CD8αTM的K562细胞;RTCA结果显示,不同效靶比下,BCMA CAR-T细胞均可有效识别、杀伤过表达BCMACD8αTM的SKOV3和CHO细胞,但同等效靶比下的Mock-T细胞无此效应。结论:本实验构建的BCMA-CD8αTM突变体能够抵抗γ分泌酶的切割,在多种靶细胞表面稳定表达,为评价BCMA CAR-T细胞体外杀伤的有效性和特异性提供多种检测手段。 展开更多
关键词 b细胞成熟抗原 Γ分泌酶 CD8α穿膜域 CAR-t细胞 杀伤功能评价
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Association of promoter polymorphism of the CD14 C (-159) T endotoxin receptor gene with chronic hepatitis B 被引量:3
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作者 Amir Houshang Mohammad Alizadeh Mitra Ranjbar +1 位作者 Mehrdad Hajilooi Farahnaz Fallahian 《World Journal of Gastroenterology》 SCIE CAS CSCD 2006年第35期5717-5720,共4页
AIM: To investigate whether single-nucleotide polymor- phisms in the promoter regions of endotoxin-responsive genes CD14 C (-159) T is associated with chronic hepatitis B. METHODS: We obtained genomic DNA from 80 pati... AIM: To investigate whether single-nucleotide polymor- phisms in the promoter regions of endotoxin-responsive genes CD14 C (-159) T is associated with chronic hepatitis B. METHODS: We obtained genomic DNA from 80 patients with established diagnosis of chronic hepatitis B and 126 healthy subjects served as a control population. The CD 14 C (-159) T polymorphism was investigated using an allele specific PCR method. RESULTS: Twenty seven percent of chronic hepatitis B patients and 75% of controls were heterozygous for CT genotype. The difference between the chronic hepatitis B and control groups was statistically significant [P < 0.0001; Odds ratio (OR) = 2.887; 95% CI: 1.609-5.178]. Twenty four point six percent of chronic hepatitis B and patients 12.3% of the control group were heterozygous for TT genotype. The difference between groups was not statistically significant (P = 0.256; OR = 0.658; 95% CI: 0.319-1.358). Forty eight point four percent of chronic hepatitis B patients and 12.7% of control were homozy- gote for CC genotype (P < 0.004; OR = 0.416; 95% CI: 0.229-0.755). The frequency of allele C was 61.9% and allele T was 38.1% in hepatitis B patients group. The frequency of allele C was 55.2% and allele T was 44.8% for the control group (P = 0.179; OR = 1.319; 95% CI: 0.881-1.977). CONCLUSION: The TT heterozygous genotype was not a risk factor for chronic hepatitis B. CC homozygote genotype is protective for hepatitis B. Lack of heterozy- gosis of genotype CT is a risk factor for chronic hepatitis B. Alleles C or T were not risk factors for chronic hepatitis B. These findings show the role of a single-nucleotide polymorphism at CD14/-159 on the development ofchronic hepatitis B. Endotoxin susceptibility may play a role in the pathogenesis of chronic hepatitis B. 展开更多
关键词 CD14 C (-159) t gene Single nucleotide polymorphism Chronic hepatitis b Endotoxin susceptibility
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Secretory Expression of Recombinant Diphtheria ToxinMutants in B. Subtilis 被引量:1
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作者 周建华 《Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences)》 SCIE CAS 1999年第4期253-256,共4页
Three diphtheria toxin (DT) mutants CRM-197, DT-del (148) and DT-El48S-K516A-F530A were cloned in B- Subtilis plasmid PSM604 under the subtilisin signal sequence. The expression was effective in both SMS300 and SMS118... Three diphtheria toxin (DT) mutants CRM-197, DT-del (148) and DT-El48S-K516A-F530A were cloned in B- Subtilis plasmid PSM604 under the subtilisin signal sequence. The expression was effective in both SMS300 and SMS118, but higher yield of 7. 1 mg/L was observed in SMS300 compared with 2. 1 mg/L in SMS118. Western blot showed that the recombinant protein could be effectively secreted into the culture medium as a 58 ku peptide, and could be de-graded into two peptides of 37ku and 21ku. 展开更多
关键词 b. Subtilis diphtheria toxin Western blot recombinant protein gene expression MUtAtION
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慢性乙型肝炎病毒感染患者CD8^(+)T细胞中LAG-3的表达特征及临床意义
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作者 张闯 申红 《医学临床研究》 CAS 2024年第2期233-236,共4页
【目的】探讨慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者CD8^(+)T细胞中淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)的表达特征及临床意义。【方法】选取2019年4月至2020年4月本院收治的60例慢性HBV患者(HBV组),另外选取同期于本院体检的60例健康志愿者作为对照组... 【目的】探讨慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者CD8^(+)T细胞中淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)的表达特征及临床意义。【方法】选取2019年4月至2020年4月本院收治的60例慢性HBV患者(HBV组),另外选取同期于本院体检的60例健康志愿者作为对照组。比较两组CD8^(+)T细胞中LAG-3表达水平、表达强度、分布频数,并测定细胞内白介素-10(IL-10)、人类白细胞抗原-DR(HLA-DR)、干扰素-γ(IFN-γ)、转录因子T-bet(T-bet)表达水平,分析LAG-3调控CD8^(+)T细胞的机制。【结果】HBV组LAG-3的表达水平、表达强度高于对照组(P<0.05)。HBV组LAG-3阳性亚群的IL-10表达水平高于阴性亚群,且HBV组LAG-3阴性亚群、阳性亚群的IL-10表达水平均高于对照组(P<0.05)。HBV组LAG-3阳性亚群的HLA-DR表达水平低于阴性亚群,且HBV组LAG-3阴性亚群、阳性亚群的HLA-DR表达水平均低于对照组(P<0.05)。HBV组LAG-3阳性亚群的IFN-γ表达水平低于阴性亚群,且HBV组LAG-3阴性亚群、阳性亚群IFN-γ表达水平低于对照组(P<0.05)。HBV组LAG-3阳性亚群的T-bet表达水平低于阴性亚群,且HBV组阴性亚群、阳性亚群IFN-γ表达水平低于对照组(P<0.05)。【结论】慢性HBV感染者在炎症作用下导致CD8^(+)T细胞内LAG-3表达水平增高,而LAG-3能通过影响IL-10、HLA-DR、IFN-γ、T-bet的表达,下调CD8^(+)T对IFN-γ的分泌量,致T细胞消耗量增加。 展开更多
关键词 乙型肝炎 慢性 t淋巴细胞亚群 基因
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甘蓝下胚轴的高效再生和农杆菌介导B.t.基因转化甘蓝 被引量:44
7
作者 卫志明 黄健秋 +5 位作者 徐淑平 薛红卫 钟仲贤 顾桢祥 徐悌惟 李贤 《上海农业学报》 CSCD 1998年第2期11-18,共8页
分别对取材时间和培养基组成进行研究,建立了甘蓝下胚轴外植体的高效再生系统,当选取6~7d苗龄的下胚轴,将其置于MSB+BA2.5mg/L+ZT1mg/L+IBA0.1mg/L的芽分化培养基中,并于培养基中附加AgNO37.5mg/L时,最高的芽分化频率... 分别对取材时间和培养基组成进行研究,建立了甘蓝下胚轴外植体的高效再生系统,当选取6~7d苗龄的下胚轴,将其置于MSB+BA2.5mg/L+ZT1mg/L+IBA0.1mg/L的芽分化培养基中,并于培养基中附加AgNO37.5mg/L时,最高的芽分化频率,“夏光甘蓝”母本“103”可达81.67%,父本“60天早椰菜”可达78.56%。在此基础上,我们对影响转化频率的不同因素,即:抑制农杆菌生长的抗生素种类及其浓度、预培养的有无及感染时的浓度、下胚轴外植体与农杆菌的感染时间和共培养时间、筛选时抗生素的加入时间进行了探讨。共获得100余株卡那霉素抗性植株,全部移栽成活,生长良好。对转基因植株总DNA进行Southernblotting分析,证明nptⅡ基因已整合到甘蓝植株细胞基因组中。 展开更多
关键词 甘蓝 下胚轴 再生 农杆菌介导 基因转化 基因
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B-ALL病人TCR Vβ基因谱系和克隆性分析 被引量:7
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作者 黄梅娟 李扬秋 +3 位作者 陈少华 杨力建 周羽竝 张涛 《肿瘤防治研究》 CAS CSCD 2004年第6期320-322,共3页
目的 了解B ALL病人外周血T细胞的TCRVβ基因谱系及其克隆性增殖情况。 方法 利用RT PCR方法扩增 13例初发未治B ALL病人外周血单个核细胞中 2 4个TCRVβ基因的互补决定区 3(CDR3) ,PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度而... 目的 了解B ALL病人外周血T细胞的TCRVβ基因谱系及其克隆性增殖情况。 方法 利用RT PCR方法扩增 13例初发未治B ALL病人外周血单个核细胞中 2 4个TCRVβ基因的互补决定区 3(CDR3) ,PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度而确定T细胞的克隆性。结果  13例B ALL病人分别表达 2~ 18个Vβ亚家族。 13例病人均存在 1个或多个Vβ亚家族的克隆增殖T细胞 ,增殖形式包括寡克隆及寡克隆增殖趋势、双克隆和单克隆。Vβ2 1和Vβ2 3亚家族出现克隆增殖性T细胞的频率较高。结论 B ALL病人外周血T细胞的TCRVβ谱系呈现优势利用的特点 ,并存在克隆性增殖的T细胞 ,这可能是机体对白血病相关抗原产生的特异性免疫反应 ;Vβ2 1和Vβ2 3亚家族T细胞发生克隆增殖改变的趋向性比较明显 ,可能与B 展开更多
关键词 b细胞-急性淋巴细胞白血病 t细胞受体VΒ基因 t细胞克隆性
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O型口蹄疫病毒VP1 T细胞与B细胞表位基因双拷贝串联表达产物的免疫应答 被引量:8
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作者 庄娟 曹祥荣 +4 位作者 陈波 饶忠 潘洁 徐泉兴 尤永进 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期494-497,503,共5页
以一株O型口蹄疫病毒(FMDV)外壳蛋白VP1基因为模板,合成与细胞免疫及体液免疫相关抗原表位肽基因:21-40肽(20AA)和141-160肽(20AA)基因序列,运用基因工程技术构建了含有串联结构21-40(20AA)~141-160(20AA)~21-40(20AA)~141-160(20AA)... 以一株O型口蹄疫病毒(FMDV)外壳蛋白VP1基因为模板,合成与细胞免疫及体液免疫相关抗原表位肽基因:21-40肽(20AA)和141-160肽(20AA)基因序列,运用基因工程技术构建了含有串联结构21-40(20AA)~141-160(20AA)~21-40(20AA)~141-160(20AA)的2020-2020VP1融合基因表达载体r2020-2020,转化宿主菌BL21(DE3)RIL后诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western Blot分析显示重组融合蛋白的分子量约为18Ku.动物实验表明,较小剂量的融合蛋白就能诱导豚鼠产生特异性T淋巴细胞增殖反应及抗FMDV中和抗体,证明该融合蛋白可同时激活细胞免疫及体液免疫反应,具有开发成为抗FMDV疫苗的应用价值. 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 VP1基因 t细胞表位 b细胞表位 双拷贝串联 免疫应答
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大肠杆菌肠毒素ST_1、LT_B基因融合及其免疫原性研究 被引量:4
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作者 许崇利 许崇波 +1 位作者 逄越 王炎林 《生物技术》 CAS CSCD 2006年第4期7-10,共4页
目的:构建大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因,并研究其表达产物的免疫原性。方法:采用PCR和基因突变技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增ST1突变基因和LTB基因,通过基因分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建含ST1-LTB融合基因表达载体的... 目的:构建大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因,并研究其表达产物的免疫原性。方法:采用PCR和基因突变技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增ST1突变基因和LTB基因,通过基因分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建含ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株,并用酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒,同时用ST1-LTB融合蛋白粗提物免疫小鼠,观察免疫攻毒保护效果。结果:构建了含ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pXSL1),ST1-LTB融合基因的序列和阅读框架均正确,其表达的ST1-LTB融合蛋白能够被ST1单抗和LTB抗体识别,且该融合蛋白已丧失天然ST1肠毒素的活性。ST1-LTB融合蛋白能够诱发小鼠产生抗体,该抗体具有中和天然ST1肠毒素的毒性作用。结论:构建的重组菌株BL21(DE3)(pXSL1)可以高效表达ST1-LTB融合蛋白,其表达产物ST1-LTB融合蛋白具有良好的免疫原性,为更有效地预防仔猪黄痢提供了一种新型基因工程菌苗候选菌株。 展开更多
关键词 St1基因 Ltb基因 融合基因 基因表达 免疫原性
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大肠杆菌SLT-IIvB基因的克隆和表达 被引量:6
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作者 倪振亚 焦新安 +2 位作者 高崧 张如宽 刘秀梵 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第6期591-597,共7页
采用聚合酶链式反应 (PCR) ,从大肠杆菌O1 38基因组DNA中分别扩增出志贺菌样毒素II型变体B的结构序列和包括信号肽的全序列两段基因 ,定向克隆进表达载体质粒pYA3334(asd+)的EcoRI、BamHI位点之间 ,构建成重组表达质粒。在大肠杆菌X62 1... 采用聚合酶链式反应 (PCR) ,从大肠杆菌O1 38基因组DNA中分别扩增出志贺菌样毒素II型变体B的结构序列和包括信号肽的全序列两段基因 ,定向克隆进表达载体质粒pYA3334(asd+)的EcoRI、BamHI位点之间 ,构建成重组表达质粒。在大肠杆菌X62 1 2(Δasd)筛选出重组质粒 pB0 和 pB1 后 ,经中间宿主X3730转化过渡 ,再导入ΔasdΔcyaΔcrp减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550 ,构建成宿主和载体之间具有平衡致死结构的SLT IIvB重组菌。SDS PAGE和Western blot分析重组菌X4550 ( pB0 )在 7 6kD左右处有一条特异性蛋白条带。动物免疫试验表明该重组菌能刺激机体产生针对SLT IIvB和沙门氏菌的特异性抗体。这为进一步研制相应的抗猪水肿病及相应沙门氏菌病的双价活疫苗奠定了重要基础。 展开更多
关键词 大肠杆菌 SLt-IIvb基因 重组疫苗载体
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幽门螺杆菌napA-ctxB融合蛋白的基因克隆与表达 被引量:2
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作者 邓颖 杨致邦 +3 位作者 王勇 黄进 张绍兰 叶翠莲 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期172-175,共4页
目的克隆、表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白napA与霍乱毒素B亚单位ctxB融合基因napA-ctxB(nctB),为制备预防H.pylori感染的疫苗奠定基础。方法用PCR方法扩增ctxB目的基因片段,克隆至pQE30-napA质粒的napA基因上游,构建含双基因的表达... 目的克隆、表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白napA与霍乱毒素B亚单位ctxB融合基因napA-ctxB(nctB),为制备预防H.pylori感染的疫苗奠定基础。方法用PCR方法扩增ctxB目的基因片段,克隆至pQE30-napA质粒的napA基因上游,构建含双基因的表达质粒pQE30-napA-ctxB(pQE30-nctB),经测序分析确认后转化E.coliDH5α,经IPTG诱导表达融合蛋白NCTB,融合蛋白NCTB经镍离子柱纯化。结果PCR扩增出807bp的目的基因片段nctB。工程菌pQE30-nctB-DH5α经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,Mr为30000,与预期的一致,约占菌体总蛋白的27%,重组蛋白用Ni2+-NTA树脂提纯,纯化后的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带,图象软件分析表明纯度可达94%以上。Westernblot显示重组蛋白质有良好的抗原性。结论构建含双基因的表达质粒pQE30-nctB成功,并在大肠杆菌DH5α中高效的表达。 展开更多
关键词 幽门螺杆菌 中性粒细胞激活蛋白 霍乱毒素b亚单位 融合基因
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可溶性BTLA真核表达载体的构建及其抗肿瘤作用 被引量:2
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作者 陈芳 朱旭昆 +4 位作者 贺宇飞 王晶 阳诺 张桂梅 冯作化 《华中科技大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期385-387,共3页
目的初步研究确定体内表达可溶性B、T淋巴细胞衰减因子(BTLA)对肿瘤生长的抑制作用,探索新的肿瘤免疫治疗途径。方法采用RT PCR及重组DNA技术构建可溶性BTLA真核表达质粒,体外细胞转染检测重组质粒的转录表达,小鼠实体瘤模型研究基因转... 目的初步研究确定体内表达可溶性B、T淋巴细胞衰减因子(BTLA)对肿瘤生长的抑制作用,探索新的肿瘤免疫治疗途径。方法采用RT PCR及重组DNA技术构建可溶性BTLA真核表达质粒,体外细胞转染检测重组质粒的转录表达,小鼠实体瘤模型研究基因转染抑制肿瘤生长的作用。结果用RT PCR从小鼠脾细胞中扩增出编码BTLA胞外段cDNA,克隆至真核表达载体pcDNA3.1,获得重组表达质粒pBTLA;体外转染BHK细胞可检测到重组质粒的转录表达;肌肉内注射转染质粒pBTLA可明显抑制H22小鼠肿瘤的生长。结论可溶性BTLA能够抑制肿瘤生长,提示B7x BTLA途径参与肿瘤免疫耐受,封闭此途径有可能成为肿瘤免疫治疗的新靶点。 展开更多
关键词 bt淋巴细胞衰减因子 免疫耐受 肿瘤 基因治疗
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幽门螺杆菌CagA蛋白与CTB融合基因的克隆及其植物表达载体的构建 被引量:5
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作者 姜云水 方平楚 +1 位作者 付亚萍 朱诚 《科技通报》 北大核心 2004年第3期189-193,共5页
目的 构建能在水稻胚乳中特异表达的幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白(CagA)和霍乱毒素B亚单位(CTB)的植物表达载体.方法 采用高保真PCR技术分别从质粒pGEM CTB和幽门螺杆菌基因组DNA中扩增出CTB和cagA基因,然后用PCR方法直接融合CTB基因和... 目的 构建能在水稻胚乳中特异表达的幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白(CagA)和霍乱毒素B亚单位(CTB)的植物表达载体.方法 采用高保真PCR技术分别从质粒pGEM CTB和幽门螺杆菌基因组DNA中扩增出CTB和cagA基因,然后用PCR方法直接融合CTB基因和cagA基因.又用PCR法改造了水稻Wx启动子,在其3′端融合加入Ω序列和Kozak序列.通过一系列亚克隆最终将两个融合基因和NOS终止子插入根癌农杆菌双元载体pCAMBI A1300的表达框架内.结果 PCR验证和测序分析证明,CTB和cagA融合基因以正确的方向插入到载体pCAMBI A1300中,并位于水稻Wx启动子后.结论 成功构建CTB和cagA融合基因的植物表达载体,为幽门螺杆菌口服疫苗的研究奠定基础. 展开更多
关键词 生物工程 幽门螺杆菌 CAGA基因 Ctb基因 水稻Wx启动子 基因融合 植物表达载体
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转染人BTLA基因细胞株的建立及其生物学功能的初步研究 被引量:1
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作者 王雪峰 陈永井 +4 位作者 王勤 杨科芳 代群 王凤鸣 张学光 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期201-204,共4页
目的:构建B、T淋巴细胞衰减子(BTLA)基因转染的细胞作为免疫原,并探讨该基因转染细胞在体外的生物学功能。方法:通过RT-PCR法从经PHA活化的人外周血T细胞中克隆出人BTLA编码区全长基因,经EcoR I和BamHI双酶切后插入逆转录病毒载体pEGZ-T... 目的:构建B、T淋巴细胞衰减子(BTLA)基因转染的细胞作为免疫原,并探讨该基因转染细胞在体外的生物学功能。方法:通过RT-PCR法从经PHA活化的人外周血T细胞中克隆出人BTLA编码区全长基因,经EcoR I和BamHI双酶切后插入逆转录病毒载体pEGZ-Term中构建成重组载体pEGZ-Term/BTLA。用脂质体法以重组逆转录病毒载体转染293T细胞,并用Zeocin抗生素进行长期筛选;流式细胞术分析BTLA在基因转染细胞膜上的表达;通过MTT法和流式细胞术探讨基因转染细胞在体外对T淋巴细胞增殖与活化的影响。结果:流式细胞术检测表明BTLA基因转染的293T细胞膜上能稳定地高表达人BTLA蛋白。BTLA基因转染的293T细胞和T细胞体外共培养显示,与未转染的293T细胞相比,该基因转染的细胞能部分地抑制抗人CD3单克隆抗体(mAb)刺激的T细胞增殖;流式细胞术和ELISA法分析揭示,该基因转染的细胞能够下调T细胞表面活化标志CD25的表达并降低IFN-γ和IL-10的分泌。结论:获得稳定高表达人BTLA基因转染的细胞株。该细胞株在体外对抗人CD3 mAb刺激的T细胞的增殖与活化具有部分地抑制作用。 展开更多
关键词 bt淋巴细胞衰减子 基因转染 t细胞 增殖
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免疫佐剂分子CTB基因的克隆与表达 被引量:1
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作者 王涛 陈建平 +2 位作者 张雷 王玉芳 马莹 《生物医学工程学杂志》 EI CAS CSCD 2004年第2期255-258,共4页
我们采用聚合酶链式反应从霍乱弧菌 5 6 9B和 M0 4 5中扩增得到霍乱弧菌 B亚基基因 ,导入载体p UC18,构建重组质粒 p CTB并转化大肠杆菌 JM10 9,并用限制性酶切分析、聚合酶链式反应、序列分析、硫酸十二烷酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳、We... 我们采用聚合酶链式反应从霍乱弧菌 5 6 9B和 M0 4 5中扩增得到霍乱弧菌 B亚基基因 ,导入载体p UC18,构建重组质粒 p CTB并转化大肠杆菌 JM10 9,并用限制性酶切分析、聚合酶链式反应、序列分析、硫酸十二烷酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western印迹进行鉴定。实验结果表明我们成功地扩增出 376 bp的霍乱弧菌 B亚基基因 ;构建免疫佐剂分子的重组质粒 p CTB;并在原核系统中表达出 12 KD的霍乱弧菌 B亚基抗原区带。 展开更多
关键词 免疫佐剂 Ctb基因 克隆技术 基因表达 聚合酶链式反应
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HBV多聚酶基因P区单位点和多位点突变、低中高HBV DNA载量、轻中重度的CHB患者外周血T淋巴细胞亚群观察 被引量:3
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作者 杨莉 侯军良 +2 位作者 冯爱东 刘腾飞 许怡 《山东医药》 CAS 2021年第36期28-31,共4页
目的观察乙型肝炎病毒(HBV)多聚酶基因逆转录保守区(P区)单位点和多位点突变、低中高HBV DNA载量、轻中重度的慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血T淋巴细胞亚群变化。方法CHB患者61例,采用基因测序确认HBV多聚酶基因P区位点突变,另取30例健康... 目的观察乙型肝炎病毒(HBV)多聚酶基因逆转录保守区(P区)单位点和多位点突变、低中高HBV DNA载量、轻中重度的慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血T淋巴细胞亚群变化。方法CHB患者61例,采用基因测序确认HBV多聚酶基因P区位点突变,另取30例健康人群作对照,比较CHB患者HBV多聚酶基因P区位点突变前后及对照组CD3^(+)、CD4^(+)、CD8;T淋巴细胞变化。61例CHB患者又根据发生P区耐药基因突变的位点个数分为单位点者(29例)和多位点者(32例),根据HBV DNA载量分为低拷贝者(6例)、中拷贝者(22例)、高拷贝者(33例),根据病情程度分为轻度者(12例)、中度者(25例)、重度者(24例),比较其外周血CD3^(+)、CD4^(+)、CD8;T淋巴细胞变化。结果与健康人群比较,CHB患者发生HBV耐药基因突变后CD3^(+)、CD4^(+)、CD8;T淋巴细胞均降低(P均<0.05);与突变前比较,CHB患者突变后CD3^(+)、CD4^(+)T淋巴细胞降低(P均<0.05)。不同位点CHB患者CD3^(+)、CD4^(+)、CD8;T淋巴细胞比较均无显著性差异(P均>0.05)。不同HBV DNA载量CHB患者CD3^(+)、CD4^(+)、CD8;T淋巴细胞比较均无统计学差异(P均>0.05)。与中度者比较,重度者CD3^(+)、CD8;T淋巴细胞降低(P均<0.05)。结论CHB患者体内病毒发生耐药基因突变后,外周血CD3^(+)、CD4^(+)T淋巴细胞消耗增多;随耐药基因突变位点增多,HBV DNA载量不断增高,患者CD3^(+)、CD4^(+)、CD8;T淋巴细胞均呈消耗增多趋势。随病情加重,患者CD3^(+)、CD4^(+)T淋巴细胞消耗不断增多,尤其病情严重期,患者CD8;T淋巴细胞消耗亦增多。 展开更多
关键词 慢性乙型肝炎 病毒载量 P区耐药基因 t淋巴细胞 拉米夫定
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弥漫大B型非霍奇金淋巴瘤患者外周血TCR Vβ亚家族T细胞分布和克隆性增生特点 被引量:3
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作者 叶静梅 谭获 +4 位作者 李扬秋 陈少华 岑东芝 陈思 吴秀丽 《临床血液学杂志》 CAS 2009年第6期594-596,共3页
目的:了解弥漫大B淋巴瘤(DLBL)患者外周血T细胞的TCRVβ基因谱系及克隆性增殖情况。方法:利用RT-PCR方法扩增6例DLBL患者外周血单个核细胞中24个TCRVβ基因的互补决定区3(CDR3),PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度而确定T... 目的:了解弥漫大B淋巴瘤(DLBL)患者外周血T细胞的TCRVβ基因谱系及克隆性增殖情况。方法:利用RT-PCR方法扩增6例DLBL患者外周血单个核细胞中24个TCRVβ基因的互补决定区3(CDR3),PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度而确定T细胞的克隆性。结果:6例DLBL患者分别表达9~20个TCRVβ亚家族。患者均存在1个或多个Vβ亚家族的克隆增殖T细胞,增殖形式包括寡克隆、寡克隆增殖趋势及双克隆。Vβ13和Vβ15亚家族出现克隆增殖性T细胞的频率较高(66.7%)。结论:DLBL患者外周血TCRVβ亚家族T细胞的分布具有特点,表现为TCRVβ亚家族T细胞呈限制性选用和克隆性增殖,这可能是淋巴瘤患者机体对淋巴瘤相关抗原产生的特异性免疫反应。 展开更多
关键词 弥漫大b细胞性淋巴瘤 t细胞受体VΒ基因 t细胞克隆性 基因扫描
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小鼠BTLA胞外段腺相关病毒载体的构建和表达 被引量:1
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作者 韩凌斐 王玲 +6 位作者 邱伟民 姚红霞 胡程 卞政 马衣努尔.买提托合提 方勇 马丁 《华中科技大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期232-235,共4页
目的构建小鼠B/T淋巴细胞弱化因子(BTLA)胞外段的腺相关病毒载体,并感染中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO)进行真核表达。方法从C57BL/6小鼠脾脏中提取总RNA,经RT-PCR扩增BTLA胞外段,然后将其克隆到腺相关病毒载体的骨架质粒中,构建重组骨架质... 目的构建小鼠B/T淋巴细胞弱化因子(BTLA)胞外段的腺相关病毒载体,并感染中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO)进行真核表达。方法从C57BL/6小鼠脾脏中提取总RNA,经RT-PCR扩增BTLA胞外段,然后将其克隆到腺相关病毒载体的骨架质粒中,构建重组骨架质粒psBTLA。重组质粒经双酶切鉴定及测序正确后,与pHELP质粒以及pRC质粒3质粒共转染293T细胞,收获含病毒的上清后用氯仿-PEG8000的方法进行纯化浓缩,再用浓缩后的病毒液感染CHO细胞,并用SDS-PAGE和Western blot检测BTLA胞外段的表达。结果获得长度为502 bp的小鼠BT-LA胞外段基因,经测序证实其序列正确。含有BTLA胞外段基因的腺相关病毒载体感染CHO细胞后,SDS-PAGE和Western blot分析证实感染的CHO细胞可表达出约21 kD的BTLA胞外段蛋白。结论成功构建小鼠BTLA胞外段基因的腺相关病毒载体,并感染CHO细胞后表达出相应蛋白,为进一步研究BTLA胞外段的功能效应奠定实验基础。 展开更多
关键词 b/t淋巴细胞弱化因子 腺相关病毒 基因克隆 真核表达
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Bcl-2、miR-451和Th17细胞在食管癌中的诊断价值及其与复发的关系 被引量:6
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作者 陈恋恋 朱春凯 郑培明 《肿瘤防治研究》 CAS CSCD 2021年第1期38-42,共5页
目的探讨Bcl-2、miR-451、Th17细胞在食管癌中的诊断价值及其与复发的关系。方法选取101例食管癌患者作为研究组,95例健康体检者作为对照组。分析两组临床病理特征与各外周血指标水平之间的相关性,ROC曲线分析各外周血指标诊断价值,多... 目的探讨Bcl-2、miR-451、Th17细胞在食管癌中的诊断价值及其与复发的关系。方法选取101例食管癌患者作为研究组,95例健康体检者作为对照组。分析两组临床病理特征与各外周血指标水平之间的相关性,ROC曲线分析各外周血指标诊断价值,多元线性回归分析各指标与肿瘤复发的关系。结果研究组外周血Bcl-2、miR-451和Th17细胞水平均高于对照组(均P<0.05);分化程度、临床分期、肿瘤直径、淋巴结转移与外周血Bcl-2、miR-451和Th17细胞水平呈正相关(均P<0.05)。复发患者外周血Bcl-2、miR-451和Th17细胞水平均高于未复发患者(均P<0.05);控制分化程度、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移等其他因素后,外周血Bcl-2、miR-451和Th17细胞水平与复发显著相关(均P<0.05)。结论食管癌患者外周血Bcl-2、miR-451和Th17细胞异常表达且表达水平与分化程度、临床分期及复发等密切相关,联合检测可为临床诊断、预后评估提供客观依据。 展开更多
关键词 b淋巴细胞瘤-2基因 微小RNA-451 辅助性t细胞17 食管癌 复发 受试者工作特征曲线
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