布鲁氏菌分子标记、毒力缺失疫苗株△S19-2的构建

通过构建自杀质粒,用定向同源重组的方法,把改造的萤火虫萤光素酶报告基因Luc NF+替换布鲁氏菌S19疫苗株Bp26基因部分片段,构建出布鲁氏菌Bp26基因缺失突变株△S19-1。在此基础上,用同样的方法,敲除△S19-1上的毒力基因Bmp18,构建成△S19-2。用PCR与萤光素酶报告基因在布鲁氏菌中表达的方法进行验证,结果表明Bp26基因与Bmp18基因改造成功,△S19-2具有Bp26基因分子标记、Bmp18毒力基因缺失的特点。

应用分子生物学技术检测布鲁氏菌抗原的研究——Ⅱ PCR技术在动物布鲁氏菌病早期诊断中的应用

用PCR技术诊断动物布病,还未见报道。作者首次用牛种布氏菌104M株100万1只的菌量感染普通小鼠,分别在感染第5d、10d 采血,同时做血清学反应和PCR检测为阳性,同时,还检查了感染15d的豚鼠,其SAT和PCR结果均为阳性,PCR和SAT在感染的后期有很高的符合率。

牛布鲁菌O链A抗原的提纯鉴定及种特异性单克隆抗体的研制

应用热酚法提纯牛布鲁菌544A的O链,经Sephades G-50纯化后,琼脂糖凝胶免疫扩散和SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳鉴定,用牛布鲁菌544A株全菌体免疫BALB/c小鼠,用纯化的O链筛选出4株针对O链表面A抗原的种特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株4B8、1C9、1G9和1E2,4株单克隆抗体均不与羊布鲁菌16 M、大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌O9、鼠伤寒沙门菌、放线杆菌发生交叉反应,具有高特异性,其中4B8的亲和常数达到了8.99×108M-1,适合用于鉴定牛种布鲁菌的研究。

牛布鲁菌单克隆抗体乳胶凝集试验方法的建立

建立了用纯化好的牛布鲁菌(B.abortus)单克隆抗体致敏乳胶的检测方法。通过试验确定了抗体致敏乳胶最佳偶联蛋白量为1.23 mg/mL,最佳致敏时间4 h,最佳的乳胶浓度为1%。水样模拟样本的制作,取含1.0×109cfu/mL灭活的B.abortus544A生理盐水菌悬液各1 mL,加入9 mL自来水中,充分混合均匀,各取1 mL,土样、奶样模拟样本制作同上。最低检出率水样为3×104cfu/mL^1.0×105cfu/mL,土样、奶样为5×104cfu/mL^1.0×105cfu/mL。

布鲁菌BP26基因的克隆、表达及纯化

目的克隆布鲁氏菌BP26基因,并在大肠杆菌中高效表达及纯化BP26蛋白。方法提取布鲁氏菌基因组DNA,用PCR扩增出BP26基因,并克隆到pMD18-T载体上,测序正确后,再亚克隆至pET-28a(+)载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经组氨酸结合树脂柱纯化,并对纯化后的表达产物进行Western blot鉴定。结果重组质粒pETBP26经Nde I与Sal I酶切后,可见大小分别为5400和700bp的片段,与理论值相符。转化大肠杆菌BL21(DE3)后,37℃诱导4h,经SDS-PAGE分析,高效表达出带有His-tag标签的融合蛋白BP26,纯化后的蛋白纯度达96%,经Western blot分析,目的蛋白具有抗原特异性。结论已成功克隆了BP26基因,且表达并纯化了布鲁氏菌BP26蛋白。

布鲁氏菌A、M因子血清的研制

研制牛种布鲁氏菌A因子血清和羊种布鲁氏菌M因子血清，用于光滑型布鲁氏菌特异性种属鉴定。将灭活牛种布鲁氏菌2308株及羊种布鲁氏菌16M株免疫1．5～2 kg家兔各5只制备高免血清。对高免血清采用抗原交叉吸附的方法，制得A、M因子血清，分装冻干后置-20℃保存。微量试管凝集试验结果显示：研制的A因子血清对16M抗原在1∶2．5时无凝集现象，对2308抗原凝集价为1∶320；研制的M因子血清对2308抗原在1∶2．5时无凝集现象，对16M抗原凝集价为1∶160。玻片凝集试验结果显示：研制的A、M因子血清对异种抗原无凝集现象。试验表明，研制的A、M因子血清具有特异性强、效价高的特点，可辅助光滑型布鲁氏菌特异性种属鉴定。

NF-κB信号通路调控布鲁氏菌胞内存活分子机制的初步研究

本试验用布鲁氏菌强、弱毒株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,旨在探讨NF-κB信号通路与布鲁氏菌强、弱毒株在胞内生存的关系。采用光滑型牛布鲁氏菌2308、粗糙型牛布鲁氏菌RB51在不同感染复数下侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,侵染0、4、8、24h后,裂解细胞收集蛋白,Western blotting检测布鲁氏菌对激活NF-κB信号通路的影响。利用不同浓度的NF-κB信号通路抑制剂处理小鼠巨噬细胞RAW264.7,然后用布鲁氏菌在不同感染复数下侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,ELISA试剂盒检测细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达量;同时对胞内菌CFU进行计数。结果显示粗糙型牛布鲁氏菌RB51可以强烈激活NF-κB信号通路,光滑型牛布鲁氏菌2308对其激活作用较弱;同时对NF-κB信号通路的激活具有浓度依赖性,在感染复数为80∶1、侵染时间为8h时光滑型牛布鲁氏菌2308和粗糙型牛布鲁氏菌RB51对NF-κB激活程度最强,且该通路参与产生TNF-α、IL-1β和IL-6;NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082影响布鲁氏菌在胞内的生存。因此,粗糙型牛布鲁氏菌RB51胞内存活与NF-κB信号通路密切相关,为进一步研究布鲁氏菌的胞内致病机制奠定基础,也为布鲁氏菌新型药物的研发、家畜布鲁氏菌病预防和治疗提供科学依据。

布鲁氏菌omp25基因真核表达载体的构建与分析

构建表达流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25的酿酒酵母表达菌并进行验证。对流产布鲁氏菌疫苗株S19外膜蛋白基因omp25设计特异引物进行PCR扩增,连接到pGM-T载体上,获得pGM-T-omp25,进行PCR扩增、酶切、测序鉴定。将质粒pGM-T-omp25与pGBKT7载体进行EcoRⅠ/SalⅠ双酶切,回收DNA片段,并进行连接,构建pGBKT7-omp25后,转化酿酒酵母菌Y187,并进行PCR鉴定、自激活实验和毒性检测。克隆了流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25,PCR、酶切、测序表明成功构建了pGBKT7-omp25真核表达载体,获得的转化子酵母Y187菌株无自激活活性,无毒性。成功构建了表达流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25的酿酒酵母表达菌,为揭示流产布鲁氏菌感染与母畜流产间的分子机制奠定基础。

流产布鲁菌BP26蛋白B细胞线性表位的鉴定

为了对流产布鲁菌BP26蛋白进行抗原表位研究,设计了3个相互重叠15个氨基酸、覆盖整个BP26蛋白的重叠短肽,经克隆并在大肠杆菌中实现了融合表达。用流产型布鲁菌感染血清对3个融合蛋白进行免疫印迹分析,结果初步鉴定出BP26蛋白B细胞线性抗原表位位于第51-165氨基酸区域。在此基础上,针对BP26 2(51-165aa)短肽,设计了5个相互重叠10个氨基酸的短肽片段,进一步鉴定出了BP26蛋白B细胞线性表位位于第109-141氨基酸区域。该结果为进一步探索BP26蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。

鉴别牛羊布鲁菌实时荧光定量PCR方法的建立

[目的]建立准确、快速检测布鲁菌、羊种布鲁菌、牛种布鲁菌的方法。[方法]以BCSP31作为布鲁菌菌属特异性基因,以IS711插入元件作为布鲁菌菌种特异性标志,设计引物和Taqman探针;分别构建标准阳性质粒模板,将其10倍倍比稀释作多重实时荧光定量PCR标准曲线,评价多重实时荧光定量PCR反应体系的敏感性、特异性、重复性。[结果]建立了鉴别牛种、羊种布鲁菌的实时荧光定量PCR方法,并用该方法对临床样品进行检测。[结论]所建立的多重实时荧光定量PCR诊断方法能够快速、准确地鉴别牛种和羊种布鲁菌。

ApoBR在布鲁氏菌侵染过程中对细胞凋亡影响的研究

目的探讨载脂蛋白B受体基因ApoBR在布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7所引起的细胞凋亡的影响。方法构建、筛选干扰ApoBR基因的慢病毒干扰载体,并干扰小鼠巨噬细胞ApoBR的表达;以牛种布鲁氏菌2308株侵染巨噬细胞,分别在侵染后4、8、12和24h收集细胞和上清液,采用实时荧光定量PCR和ELISA法检测ApoBR基因、肿瘤坏死因子TNF-α以及凋亡相关基因Bax、Bcl-2表达水平;做胞内菌的CFU计数,利用流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果慢病毒转染后pLentiLox-253和pLentiLox-1325组ApoBR mRNA细胞抑制率分别为53.3%和57.4%;TNF-α表达水平较对照组升高(P<0.05);CFU计数显示,细菌侵染后8h,巨噬细胞凋亡抑制率达到最高,253实验组抑制率为71.7%,1325实验组抑制率为67.0%;在不同时间点促凋亡基因Bax表达水平上调,而抑制凋亡基因Bcl-2表达水平下调。结论载脂蛋白B受体蛋白在布鲁氏菌早期感染引起的细胞凋亡过程中起到减缓细胞凋亡的作用,为进一步研究布鲁氏菌在巨噬细胞内的分子机制奠定了基础,也为寻找治疗布鲁氏菌的有效药物和疫苗提供了理论依据。

牛布鲁菌L7/L12蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化牛布鲁菌L7/L12蛋白。方法提取牛布鲁菌S19基因组DNA,PCR法扩增L7/L12基因,经测序正确后,克隆至pET-28a(+)载体,构建重组原核表达质粒pET-L7/L12,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式及表达量,经亲和层析纯化后,Western blot鉴定纯化产物。结果所构建的重组原核表达质粒pET-L7/L12经酶切鉴定表明构建正确。重组蛋白以包涵体形式表达,表达量占全菌总蛋白的33%;纯化的重组蛋白纯度可达94%,可与布鲁菌小鼠免疫血清发生特异反应。结论已成功表达并纯化了牛布鲁菌L7/L12蛋白,为建立高特异性的新型布鲁菌检测方法奠定了基础。

马流产沙门菌重组鞭毛蛋白FliC和FljB免疫原性比较

为评价与比较马流产沙门菌(Salmonella abortus equi)2种不同鞭毛蛋白FliC(Flagellin C)和FljB(Flagellin B)的免疫原性,为进一步利用这两种蛋白奠定实验基础,本研究诱导表达及纯化FliC和FljB蛋白,将纯化后的蛋白分别免疫小鼠,对免疫后小鼠的抗体水平、滴度及抗体亚型进行检测,攻击小鼠后进行免疫相关受体检测及病理组织学观察。结果显示,成功诱导表达了重组蛋白FliC和FljB,纯化后蛋白的相对分子量分别为52 kDa和42 kDa。两种蛋白分别免疫小鼠,产生较高水平的特异性抗体IgG,FljB免疫组抗体水平高于FliC免疫组,且抗体亚型以IgG1为主。FljB免疫组攻击保护率为87.5%,高于FliC免疫组的75%,病理组织学及脏器荷菌数检测结果显示,FljB免疫组效果优于FliC免疫组;FljB免疫组诱导TLR2、TLR4、MHC-I、TCR(T细胞抗原受体)的水平均高于FliC免疫组。该结果表明,FljB免疫组诱导小鼠免疫应答的水平高于FliC免疫组。