C57BL/6小鼠黑色素瘤B16细胞株在ICR小鼠肿瘤模型的建立

目的 : 在白色ICR小鼠建立B16细胞株黑色素瘤模型 ,以便于接种、测量和观察 ,既能降低研究成本 ,又能满足不同实验目的要求。 方法 :将B16细胞株黑色素瘤对数生长期细胞接种于ICR小鼠足垫、皮下、腹腔和尾静脉等部位 ,建立移植瘤模型和肺部转移瘤模型。观察小鼠成瘤特点 ,并作病理和免疫组化染色检查 ,分析接种细胞数与肿瘤生成的关系以及肿瘤生长对小鼠生活状态和生存时间的影响。 结果 :6天后白色小鼠浅表部位和深部脏器 (解剖后 )可陆续观察到芝麻样或点线状到结节状、菜花状黑色瘤组织 ,直到发展至溃烂和 (或 )小鼠死亡。成瘤率与接种细胞数成正比 ,在接种细胞数 >1× 10 6 后成瘤率为 10 0 %。 结论 :B16细胞株黑色素瘤在ICR小鼠具有成瘤率高、观察和测量方便、费用低等优点 。

榄香烯乳对B16细胞株的诱导分化作用

观察榄香烯乳对Ｂ１６黑色素瘤细胞株是否具有诱导分化作用。通过ＭＴＴ显色法测定榄香烯乳在体外对Ｂ１６细胞株的ＩＣ５０，腹腔给药观察榄香烯乳对体内Ｂ１６细胞株皮下、肺转移结节的抑制作用．选取低于ＩＣ５０的药物浓度研究榄香烯乳作用后Ｂ１６细胞株超微结构和成瘤性的改变．榄香烯乳对体内外Ｂ１６细胞株均有抑制作用．药物作用后，瘤细胞生长抑制，增殖减慢，接触抑制恢复，成瘤性降低，电镜观察细胞恶性度下降，出现较为成熟的黑色素颗粒．在低浓度时。

高表达重组Ret蛋白B16细胞株的建立

目的:探讨建立高表达重组Ret蛋白的B16细胞株的方法,为Ret抗原的免疫原性研究提供靶细胞。方法:通过常规分子克隆的方法,构建Fxyd3-Ret嵌合蛋白的真核表达质粒pIRES-rFxyd3-His-Ret-neo2;将该质粒转染293细胞以验证构建质粒的可行性;将该质粒转染B16细胞,通过筛选获得Fxyd3-Ret蛋白高表达的阳性细胞株。结果:PCR和酶切验证pIRES-rFxyd3-His-Ret-neo2的产物片段大小符合预期,Western blot对转染pIRES-rFxyd3-His-Ret-neo2质粒的细胞进行检测,发现在转染细胞内有目标蛋白高表达。结论:成功构建了pIRES-rFxyd3-His-Ret-neo2真核转染质粒;成功建立了Ret蛋白高表达的B16细胞株。

丹参对小鼠黑色素瘤细胞株B16-BL6侵袭和转移能力的影响

目的研究活血化瘀中药丹参对小鼠黑色素瘤高转移细胞株B16-BL6生长、粘附、侵袭、运动、转移能力的影响,并初步探讨其作用机制。方法采用MTT法测定丹参对B16-BL6细胞增殖能力的影响;采用细胞粘附实验、重组基底膜侵袭实验、趋化性运动能力实验以及小鼠黑色素瘤自发性转移模型,观察丹参对B16-BL6细胞生长、粘附、侵袭、运动及转移能力的影响。结果丹参水提液对B16-BL6细胞的增殖具有双向调节作用;能显著促进B16-BL6细胞与基底膜成分纤维粘连蛋白粘附,显著抑制B16-BL6细胞侵袭基底膜能力及趋化性运动能力;能显著减小肺转移结节体积,但对结节数目没有明显作用。结论丹参提取液能够显著减轻小鼠黑色素瘤高转移细胞株B16-BL6的肺转移程度,可能与其能够抑制B16-BL6细胞对基底膜的侵袭能力以及降低B16-BL6的运动能力有关。

氨氯地平抑制小鼠黑色素瘤高转移细胞株B16体内转移的作用及相关机制研究

目的:研究不同剂量氨氯地平抑制小鼠黑色素瘤高转移细胞株B16转移的作用,并探讨其作用机制。方法:选取64只C57BL/6J小鼠,将黑色素瘤髙转移细胞株B16接种在小鼠腹股沟皮下(2×106个/只)。将接种后的小鼠以随机数字表法分为对照组和氨氯地平高、中、低剂量治疗组,对照组小鼠仅给予0.9%氯化钠注射液;治疗组小鼠给予不同剂量的氨氯地平治疗,分别为1 mg/kg(低剂量组)、3 mg/kg(中剂量组)和10 mg/kg(高剂量组)。观察各组小鼠肿瘤生长情况及身体情况;观察各组小鼠肿瘤肺转移情况,计算肺转移的结节及肿瘤抑瘤率;采用免疫组织化学法检测各组小鼠肿瘤组织中白细胞介素8(IL-8)蛋白表达水平;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组小鼠肿瘤组织中IL-8的信使核糖核酸(mRNA)表达水平。结果:氨氯地平对小鼠黑色素瘤高转移细胞株B16的自发性肺转移有显著的抑制作用;治疗组小鼠肿瘤组织中IL-8蛋白表达均明显减弱,且随氨氯地平剂量的增加而减弱;治疗组小鼠肿瘤组织中IL-8的mRNA的表达明显低于对照组,且IL-8的mRNA的表达随氨氯地平剂量的增加而减弱。结论:氨氯地平对小鼠黑色素瘤高转移细胞株B16有一定的抑瘤和抑制肺转移作用,其作用可能与影响IL-8的表达有关。

三氧化二砷对黑素瘤B_(16)细胞内活性氧自由基的影响

目的：探讨三氧化二砷（As2O3）对黑素瘤B16细胞增殖及细胞内活性氧自由基（ROS）水平的影响。方法：30μmol/LAs2O3与500μmol/L N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）分别单独或联合作用于B16细胞,应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定细胞生长抑制情况;流式细胞术检测ROS水平。结果：As2O3能明显抑制B16细胞的增殖,NAC可部分拮抗As2O3对黑素瘤细胞的杀伤效应及诱导凋亡效应。As2O3作用1 h后的B16细胞内ROS水平比对照组升高（P〈0.01）,4 h达到高峰,24 h有所下降,与对照组差异均有统计学意义（P〈0.01）。ROS升高的趋势可被抗氧化物NAC部分阻断（P〈0.05-P〈0.01）。结论：As2O3诱导B16细胞凋亡与ROS水平改变有关,As2O3可通过提高细胞内ROS水平诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用,这也可能是As2O3抗黑素瘤的途径之一。

非髓性淋巴细胞12删除对B16黑色素瘤动物模型生存期的影响

目的利用C57BL/6小鼠制备黑色素瘤动物模型,选择合适的造模条件并观察非髓性淋巴细胞删除(NMLD)对该动物模型生存期的影响。方法黑色素细胞株B16制备成不同浓度的细胞悬液,分为1×105/ml、1×106/ml、5×106/ml和1×107/ml 4组。注射于小鼠背部,每组小鼠15只。于注射7 d后采用不同方法进行全身照射,达到NMLD。观察小鼠的出瘤时间、生存期及小鼠生活习性的改变。结果 4组小鼠出瘤率均为100%。浓度越高出瘤时间及生存期越短,生活习性改变越明显。结论选择背部为注射部位,较方便。细胞浓度为1×106/ml制备的动物模型,出瘤时间和生存时间更适于实际工作;NMLD对黑色素细胞瘤动物模型的生存期没有显著影响。

构建稳定表达PDL1的B16F10细胞株

目的通过转染及流式细胞仪(flow cytometry,FCM)筛选出稳定表达小鼠细胞程式死亡配体1(Programmed cell death ligand 1,PDL1)的B16F10细胞株。方法将携带PDL1的真核表达质粒通过脂质体法转染到B16F10细胞株中,经FCM进行多次分选,筛选出稳定表达PDL1的B16F10细胞株,将其与抗CD3/抗CD28抗体活化的CD4^+T细胞共培养48 h后,FCM检测CD4^+T细胞表面CD69以及CD25的表达。结果建立了稳定表达PDL1的B16F10细胞株,该细胞株表面的PDL1可诱导CD4^+T细胞高表达CD25。结论成功地得到了稳定表达PDL1的B16F10细胞株,为后续研究奠定了物质基础。

氧化苦参碱对B16-BL6细胞转移作用的影响

目的探讨氧化苦参碱抗肿瘤转移的作用及其作用机制。方法在黑色素瘤细胞(B16-BL6细胞株)培养液中加入梯度浓度(0、1、10、20、50、100μmol/L)的氧化苦参碱,并采用MTT法检测肿瘤细胞增殖抑制率。采用静脉注射方法建立肿瘤转移小鼠模型,以低剂量和高剂量(20 mg/kg,40 mg/kg)两个剂量组灌胃治疗,23 d后解剖小鼠对肺部转移灶计数观察。并取定量肺组织,取匀浆。以ELISA法检测金属蛋白酶MMP-2,MMP-9的含量。结果在体外实验中氧化苦参碱可抑制黑色素瘤细胞的增殖,并存在量效关系。IC50值为38.6μmol/L。动物实验中低剂量和高剂量组肺部转移灶都比模型组少,并有显著差异(P<0.05或P<0.01)。低剂量和高剂量组的肺组织的MMP-2,MMP-9的表达量均减少,与模型组比较有显著差异(P<0.05或P<0.01)。结论氧化苦参碱对肿瘤细胞有抑制作用,并可抗肿瘤转移,其作用部分机制可能与抑制金属蛋白酶MMP-2,MMP-9表达有关。

三氧化二砷抑制恶性黑色素瘤B_(16)细胞核酸合成的研究

目的:研究不同浓度的三氧化二砷(As2O3)对恶性黑色素瘤B16细胞核酸合成抑制及诱导B16细胞凋亡的作用,探讨砷及其化合物治疗恶性黑色素瘤的作用机制,为其治疗恶性黑色素瘤提供新的理论和实验依据。方法:采用3HTdR和3HUdR掺入肿瘤细胞DNA和RNA的方法,观察不同浓度的As2O3对恶性黑色素瘤B16细胞核酸生物合成的抑制作用;用流式细胞术(FCM)检测As2O3诱导B16细胞的凋亡及细胞毒作用。结果:As2O3对恶性黑色素瘤B16细胞核酸合成抑制和诱导凋亡及细胞毒作用有显著的浓度和时间依赖关系(P<0.01)。结论:As2O3对恶性黑色素瘤B16细胞核酸合成的抑制作用和诱导凋亡及细胞毒作用随药物浓度的增加和作用时间的延长而增强。

姜黄素对黑色素瘤B16-F10细胞增殖及线粒体凋亡影响的机制研究

目的:探讨姜黄素体外抗黑色素瘤的药效及作用机制,为姜黄素抗肿瘤的药理机制提供实验依据。方法:以黑色素瘤B16-F10细胞为实验材料,在离体水平研究姜黄素对细胞活力、细胞内活性氧水平、细胞凋亡的影响[1]。结果:姜黄素能显著抑制B16-F10细胞增殖、促进其凋亡;姜黄素可促进B16-F10细胞活性氧水平增高,且显著提高细胞内Caspase-4,9蛋白的表达,可能通过启动线粒体凋亡途径发挥促癌细胞凋亡生物活性。结论:姜黄素对黑色素瘤具有显著抑制作用[2],其可能的机制是通过提高细胞内活性氧水平,启动线粒体凋亡途径而发挥促黑色素瘤细胞凋亡的作用。

B16黑色素瘤动物模型制备方法探讨

目的利用C57BL/6小鼠制备黑色素瘤动物模型,选择合适的造模条件。方法将黑色素瘤细胞株B16制备成1×108L-1、1×109L-1、5×109L-1、1×1010L-1浓度的细胞悬液,分别注射于小鼠背部,观察小鼠的出瘤时间、生存期及小鼠生活习性的改变。结果小鼠出瘤率为100%。浓度越高出瘤时间、生存期越短,生活习性改变越明显。结论选择背部为注射部位较方便,细胞浓度为1×109L-1制备的动物模型,出瘤时间、生存时间更适于实际工作。

人血型B抗原模拟多肽P1/Fas-Mip3β双表达重组质粒的构建及鉴定

目的构建并鉴定人血型B抗原模拟多肽、巨噬细胞炎症蛋白3β(Mip3β)双表达重组质粒。方法抗血型B抗体筛选噬菌体随机12肽库,筛选阳性噬菌体克隆P1,设计特异性引物扩增P1噬菌体DNA,同样设计特异性引物扩增PBluscript-Fas基因的跨膜区及胞内段,与P1酶切连接,最后与质粒PORF5-mMip3βv21扩增巨噬细胞炎症蛋白3β基因酶切连接,获得血型B抗原模拟多肽、Mip3β双表达重组质粒并进行鉴定,并在人黑色素瘤细胞株B16中转染与表达。结果和结论成功制备了血型B抗原模拟多肽、Mip3β双表达重组质粒,并在黑色素瘤细胞株B16中成功表达。

三种黑素瘤动物模型的建立

目的:建立黑素瘤动物模型,用于抗黑素瘤药物的疗效评价。方法:分别通过皮下、静脉和腹腔注射方式,将B16F10黑素瘤细胞接种于小鼠体内,建立3种黑素瘤及其肺转移小鼠模型,并以达卡巴嗪作为试药,考察其对这3种模型小鼠的作用。结果:成功建立了小鼠皮下、肺转移及腹腔黑素瘤模型。达卡巴嗪对3种模型均有明显的治疗作用。结论:这3种黑素瘤动物模型可综合用于新药的临床前评价。