B3型柯萨奇病毒感染对胰岛细胞糖尿病相关LncRNA表达的影响

目的:探讨B3型柯萨奇病毒诱发糖尿病发生的具体机制。方法:采用B3型柯萨奇病毒感染人胰岛细胞HUM-CELL-0058,病毒感染48 h后提取细胞总RNA并通过荧光定量PCR检测糖尿病相关LncRNA。对调控三种LncRNA转录的转录因子mRNA及蛋白采用实时定量PCR及Western blot进行监测。构建了PAX6及NF-κB的过表达质粒,并转染病毒感染后的胰岛β细胞,检测柯萨奇病毒感染后异常表达LncRNA的表达水平。结果:糖尿病相关LncRNA,Lnc-P12792和MALAT1有上调表达,上升2~3倍(P<0.01),而HI-Lnc45的表达水平约为对照组的60%(P<0.01)。实时定量PCR及Western blot结果表明调控HI-Lnc45表达的转录因子PAX6表达量降低50%而调控Lnc-P12792和MALAT1的转录因子NF-κB(p65)表达升高 2.5 倍(P<0.001),这与其调控的转录因子趋势一致。表明LncRNA的表达差异是由于该基因转录因子表达异常所导致。实时定量结果表明,三种异常表达LncRNA的mRNA水平回归B3型柯萨奇病毒感染前的正常水平,证明这一趋势可被调控这两种转录因子的表达量所拯救。结论:B3型柯萨奇病毒感染人胰岛β细胞会引起转录因子NF-κB的上调表达以及PAX6的下调表达,并引起下游与糖尿病发生有关LncRNA的异常表达,这可能是B3型柯萨奇病毒诱发糖尿病发生的病理机制之一。

含融内体多肽的新型B3型柯萨奇病毒DNA疫苗对小鼠病毒性心肌炎的预防作用

目的 改良新型B3型柯萨奇病毒 (CVB3)DNA疫苗chitosan pcDNA3 VP1,增强其预防CVB3性心肌炎的效果。方法 合成含融内体多肽和多聚赖氨酸的“载体多肽”HApLys16 ,与pcDNA3 VP1、脱乙酰壳多糖 (chitosan)依次复合制备chitosan pcDNA3 VP1 HApLys16疫苗 ,以含 2 0 0 μgDNA剂量疫苗隔周滴鼻免疫小鼠 ,3周后以 3×半数致死剂量 (LD50 )CVB3感染小鼠致病毒性心肌炎 ,检测感染后体重、体重 /心脏重比、心肌HE染色和心脏外观评价病毒性心肌炎预防效果。结果 (1)chitosan pcDNA3 VP1 HApLys16疫苗免疫组黏膜sIgA分泌增高。 (2 )病毒感染后体重显示 :pcDNA3组减重 4 .5 0 % ,chitosan pcDNA3 VP1组和chitosan pcDNA3 VP1 HApLys16组分别增重 1 75 %和 5 .4 4 %。 (3)感染后体重 /心脏重比值显示 :chitosan pcDNA3 VP1 HAplys16组比值最大 ,为 193.77,病毒性心肌炎的体征最轻。 (4)感染后心肌病理显示 :pcDNA3组 10 0 %发生严重病毒性心肌炎 ;chitosan pcDNA3 VP1组发病率 16 .7% ,程度轻 ;chitosan pcDNA3 VP1 HApLys16组不发病 ,心肌完全正常。 (5 )心脏外观显示 :pcDNA3组心脏增大有疤痕状白斑 ;chitosan pcDNA3 VP1组心脏基本正常 ;chitosan pcDNA3 VP1 HApLys16组心脏正常 ,提示无病毒性心肌炎发生。

儿童急性暂时性髋关节滑膜炎与柯萨奇B组3型病毒感染的相关性研究

目的 :探讨儿童急性暂时性髋关节炎与柯萨奇B组 3型病毒的相关性。方法 :采用ELISA法检测 10 0例急性暂时性髋关节滑膜炎患儿血清及髋关节液中柯萨奇B组病毒 (CoXB)、腺病毒 (AdV )、巨细胞病毒 (CMV)、呼吸道合胞病毒 (RSV)抗体 ,其中 79例作病毒血清免疫学检测 ,2 1例作髋关节病毒学检测 ,怀疑柯萨奇病毒感染者 ,随机抽样 9例作髋关节液中的病毒分离。结果 :急性暂时性髋关节滑膜炎患儿 79例血清免疫学检测查出Coxb lgM阳性 11例 ,AdV lgM阳性 14例 ,CMV lgM阳性 8例 ,RSV lgM阳性 8例 ,3 8例阴性。 2 1例髋关节液中查出CoXB阳性 7例 ,AdV阳性 5例 ,CMV阳性 2例 ,7例阴性。同时在血液和髋关节液中查出CoXB阳性 1例 ,AdV阳性 2例。随机抽样 9例作病毒分离培养 ,1例分离出柯萨奇病毒 ,采用中和试验证实为柯萨奇B组 3型病毒 ,并经电子显微镜检查确认。结论 :柯萨奇B组 3型病毒具有感染儿童导致急性暂时性髋关节滑膜炎的可能性。

虎杖蒽醌提取物抗柯萨奇B3型病毒作用及机制研究

目的研究虎杖蒽醌提取物抗柯萨奇B3型病毒(Coxsackie B3virus,CoxB3)的作用。方法通过对病毒性心肌炎致病有关的CoxB3型病毒体感染模型,观察虎杖蒽醌提取物对CoxB3型病毒感染宿主细胞的抑制作用及对病毒性心肌炎小鼠的治疗作用。结果虎杖蒽醌提取物对感染细胞的治疗指数(TI)分别为6.73(Vero)和4.00(原代培养心肌细胞);对照品抗病毒口服液组TI为4.01(Vero)和3.56(原代培养心肌细胞);虎杖蒽醌提取物对CoxB3病毒感染细胞的TI高于抗病毒口服液(P<0.05)。小鼠感染病毒后,各给药组血清中乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸转移酶(ASTase)、肌酸激酶(CK)水平显著降低(P<0.001)。结论虎杖蒽醌提取物对由CoxB3型病毒引起的病毒性心肌炎具有一定的治疗作用。

柯萨奇病毒B组3型VP1基因真核表达重组质粒的构建及免疫效果

目的构建柯萨奇病毒B组 3型 (CoxsackievirusesgroupB3,CVB3)VP1基因的真核表达重组质粒pcDNA3/VP1,并观察它对小鼠的免疫保护作用。方法从CVB3感染细胞中扩增出VP1片段 ,构建真核表达重组质粒 pcDNA3/VP1,经大量扩增纯化后 ,肌内注射免疫BALB/c小鼠 ,每次免疫后的第 6天 ,断尾取血检测CVB3中和抗体 ;3次免疫后用致死量 (10 0 0TCID50 )的CVB3感染小鼠 ,观察 pcDNA/VP1对小鼠的免疫保护作用。 结果pcDNA3/VP1重组质粒免疫小鼠后 ,能诱导机体产生中和抗体 ,各次免疫后抗体滴度分别为 <1∶5 ,1∶5 .7和1∶34.8;用致死量CVB3感染小鼠 ,pcDNA3/VP1重组质粒免疫组、pcDNA3质粒对照组及生理盐水对照组生存率分别为 30 %、2 0 %及 15 % ,3组小鼠生存率无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论 pcDNA3/VP1重组质粒在小鼠体内能够表达并能诱导机体产生中和抗体 ,抗体滴度随免疫次数增加 。

柯萨奇病毒B3型诱导的免疫偏离与心肌炎发病关系的研究

目的研究2种近交系小鼠在柯萨奇病毒B3型(CVB3)感染后辅助性T细胞(Th)免疫偏离对心肌炎发病的影响。方法用CVB3腹腔感染BALB/c和C57BL/62种近交系小鼠,感染后7d通过检测小鼠血清肌酸激酶(CK)活性,观察心脏外观变化以及心脏石蜡切片H.E染色观察心脏病理改变,比较2种小鼠心肌炎的发病情况;通过体外感染心肌细胞观察病毒复制情况以及体内心脏组织病毒载量的分析,比较2种小鼠对病毒感染和复制的差异;通过检测感染小鼠细胞因子白细胞介素-4(IL-4)、IL-12和γ干扰素(IFN-γ)的表达,抗CVB3VP1抗体的亚型以及T-bet和Gata-3的表达,比较2种小鼠Th免疫偏离的情况。结果CVB3在体外和体内都可以感染BALB/c和C57BL/6小鼠心肌细胞,但仅BALB/c小鼠感染后可发生明显的病毒性心肌炎,C57BL/6小鼠则不能;BALB/c小鼠感染后表现为Th1型免疫反应而C57BL/6小鼠则偏向于Th2型免疫反应。结论CVB3感染2种品系小鼠表现为不同的心肌炎发生率,与其诱导了不同类型的免疫偏离密切相关。

柯萨奇病毒B3型感染引起HeLa细胞内源性小干扰RNA的变化

探究柯萨奇病毒B3型(Coxsackie virus type B3,CVB3)感染的细胞是否诱导内源性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的产生。以CVB3接种HeLa细胞,在细胞培养箱(5%CO 2、37℃)孵育1 h。随后加入含2%血清的细胞维持液,继续培养3 h和6 h后收集细胞。用高通量测序(二代测序)试剂盒提取细胞RNA,并反转录合成cDNA,构建文库,上机测序。过滤数据,去除插入片段过长的序列、低质量序列、poly A序列和小片段序列,与已知的小RNA数据库比对鉴定siRNA。通过茎-环反转录-聚合酶链反应,证实内源性siRNA在感染CVB3后的表达。结果显示,感染CVB33 h和6 h后,HeLa细胞产生了多种内源性siRNA。其中内源性siRNA(novel_sir3502和novel_sir2806)在感染后3 h和6 h均可持续表达。经比对,novel_sir3502和novel_sir2806均可以识别45S和28S核糖体前体RNA。结果提示,CVB3感染可能干扰核糖体成熟。

双黄连抗柯萨奇B_3型病毒感染大鼠原代心肌细胞的效应

目的 观察双黄连抗柯萨奇B3 病毒感染原代大鼠心肌细胞的作用 ,并初步探讨其机制。方法 选用出生 1～ 3天的Sprague Dawley大鼠 ,取其心室肌组织 ,制备原代大鼠心肌细胞 ,培养 72h后 ,用不同浓度的双黄连对抗10 0TCID50 柯萨奇B3 型病毒感染细胞 ,观察细胞病变 ,测定感染 36h后细胞上清液中的病毒滴度及肌酸磷酸激酶。结果 0 5、0 2 5、0 12 5 g/L双黄连均可明显减轻心肌细胞病变 ,降低细胞上清液的病毒滴度 ,减少感染心肌细胞肌酸磷酸激酶的释放 (分别和病毒对照组相比 ,P <0 0 1)。结论 双黄连对柯萨奇病毒感染的新生大鼠原代心肌细胞有保护作用。

表达红色荧光蛋白重组柯萨奇病毒B组3型基因组稳定性分析

本文旨在分析含红色荧光蛋白mCherry基因的重组柯萨奇病毒B组3型(CVB3)基因组的稳定性。用重组质粒pCVB3-mCherry转染HeLa细胞,观察细胞病变和mCherry的表达。收获病毒后,用噬斑形成实验纯化病毒并测定病毒毒力。将重组病毒CVB3-mCherry在HeLa细胞中连续传代,提取第2～6代重组病毒总RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出报告基因mCherry及CVB3部分序列,进行测序分析。结果表明,pCVB3-mCherry转染的HeLa细胞出现细胞病变并表达红色荧光蛋白mCherry;从第2代开始,CVB3-mCherry出现报告基因mCherry及部分CVBVP4基因序列丢失,基因序列丢失导致病毒开放读码框架移位。本研究表明,mCherry基因序列的插入导致CVB3基因组不稳定。随着病毒的传代逐渐丢失插入的报告基因mCherry及CVB3基因组的部分序列,病毒读码框架移位,产生致死性突变株。因此,应用CVB3-mCherry时,病毒的传代次数不超过2代,否则应重新从重组质粒中收获病毒,并对每代重组病毒进行纯化和毒力测定。

一株引起无菌性脑膜脑炎柯萨奇B组3型病毒的分离和VP1基因分析

摘要目的对一株从无菌性脑膜脑炎患者中分离到的柯萨奇B组3型病毒（coxsackievirusB3，CVB3）分离株KMA103-09进行VP1区的基因特征分析。方法采用Hep-2、RD细胞对患者粪便标本进行病毒分离，肠道病毒组合血清进行鉴别，反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）扩增病毒目的片段，测序后进行VP1基因分析，用Mega4．1等软件分析处理。结果肠道病毒组合血清鉴别为柯萨奇病毒B组3型（Cox．B3），从病毒性脑膜脑炎患者粪便标本中，分离到CVB3，其VPl区的核苷酸长度为849bp，未发现核苷酸插入与丢失。与山东04433／SD／CHN／2004／CB3株、山东05280／SD／CHN／2005／CB3株及山东YZ127／SD／CHN／2005／CB3株氨基酸同源，与其余国内分离株同源性高于为99．29％，与国外毒株的同源性为95．41％-96．47％。在进化树上与AM06HZ／SD／CHN／2006／CB3株显示在同一个分支上。结论分离的肠道病毒为柯萨奇病毒B组3型（Cox．B3），分离株（KMA103—09）VP1区变异较小。

柯萨奇病毒B组3型VP1基因的体外表达和鉴定

将克隆的CVB3VP1基因亚克隆至真核表达载体 pCEP4构建CVB3VP1的真核表达质粒 pCEP4 CVB3VP1。pCEP4 CVB3VP1转染HeLa细胞 ,蛋白印迹试验证明该表达体系可以在体外表达能为CVB3中和抗体识别的VP1蛋白。

柯萨奇病毒B组3型上海分离株的基因特征分析

为探讨上海市不同来源的柯萨奇病毒B组3型(coxsackievirus B3,CVB3)菌株的循环动态变化及基因特征,本研究对分离自上海市环境污水、健康儿童和急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)病例中的CVB3菌株进行VP1区基因序列测定,并对照全球CVB3代表株进行序列相似性分析和系统发生学分析。结果显示,1989-2021年上海市不同来源的CVB3分离株共有120株,属于D、E基因亚型。上海CVB3分离株的核苷酸和氨基酸相似性差异较大,分别为78.7%~100%和93.3%~100.0%。2016年首次从上海环境污水中分离到E基因亚型CVB3,2021年再次分离到该基因亚型。2021年上海环境污水中的E基因亚型CVB3分离株与2020年的广东手足口病(hand,foot,and mouth disease,HFMD)病例CVB3分离株VP1区的核苷酸相似性较高,但上海暂未有该基因亚型感染病例报道。因此,仍须长期对环境污水和不同肠道病毒感染病例进行监测,以提高肠道病毒监测的敏感性,为肠道病毒相关疾病的诊疗提供数据支撑。

H9c2细胞对B组柯萨奇病毒3型重组株的易感性

H9c2细胞是来源于大鼠胚胎心脏组织的成肌细胞系,B组柯萨奇病毒(group B Coxsackievirus,CVB)是心肌炎和扩张型心肌病的主要病原。本研究观察了CVB3在H9c2细胞中的感染性,探讨H9c2细胞是否可用于CVB致心肌疾病的实验研究。用整合了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)或海肾荧光素酶(RLuc)的CVB3重组株EGFP-CVB3、RLuc-CVB3攻击H9c2细胞及大、小鼠原代心肌细胞和骨骼肌细胞,应用荧光显微镜、流式细胞术和化学发光技术观察感染细胞的EGFP和RLuc表达,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测病毒在核酸水平的表达。结果显示,在病毒攻击的H9c2细胞未检测到EGFP和RLuc表达;RT-PCR显示在CVB3感染9 d后检测不到CVB3 RNA;CVB3毒株可感染小鼠心肌细胞、骨骼肌细胞和大鼠心肌细胞,但不感染大鼠骨骼肌细胞和H9c2细胞。本研究结果表明,H9c2细胞不是CVB3易感细胞,不能用于CVB3致心肌疾病的研究;该结果从病毒感染方面也支持H9c2具有大鼠骨骼肌细胞表型。

柯萨奇B_3病毒性心肌炎模型小鼠的免疫学指标检测

目的 :建立急性病毒性心肌炎小鼠模型并检测其免疫功能指标。方法 :腹腔注射CVB3 建立急性病毒性心肌炎小鼠模型 ,用MTT比色法检测NK、TNF、IFN的活性 ;进行小鼠心肌组织病毒分离、病理检查 ,检测小鼠体重、心脏及脾脏重量变化。结果 :CVB3 感染鼠的体重及心脏、脾脏的重量均明显减轻 ;血清中TNF活性及脾细胞诱生TNF量显著增高 ;脾脏NK活性增高 ,但脾细胞诱生IL - 2量降低 ;IFN无明显变化。结论 :急性病毒性心肌炎模型小鼠的NK活性。

B3型柯萨奇病毒感染的胰岛β细胞中microRNAs表达的变化及生物学意义

B3型柯萨奇病毒(Coxsackie virus B3,CVB3)感染与1型糖尿病发病及胰岛β细胞损伤有关,但机制并不清楚。病毒性心肌炎的研究证实CVB3通过调控微小RNA(microRNAs,miRNAs)的表达引起心肌细胞损伤。本研究的目的是观察CVB3感染的胰岛β细胞中miRNAs表达的变化及生物学意义,进而初步探究CVB3感染引起胰岛β细胞损伤的分子机制。本研究培养了人胰岛β细胞株,感染CVB3后采用miRNAs芯片及荧光定量PCR检测miRNAs表达的变化;转染miR-阴性对照(NC)或miR-146a-5p后感染CVB3,检测细胞活力、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)及白介素-1β(IL-1β)的含量、IRAK-1及TRAF-6的表达水平;采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-146a-5p靶向IRAK-1及TRAF-6。结果显示:CVB3组中miR-101a-3p、miR-140-5p、miR-146a-5p、miR-146b-5p、miR-340-5p的表达水平均低于对照组且miR-146a-5p表达降低最显著;miR-NC+CVB3组的细胞活力、miR-146a-5p表达水平均低于miR-NC组,TNF-α、IL-1β的含量及IRAK-1、TRAF-6的表达水平均高于miR-NC组;miR-146a-5p+CVB3组的细胞活力高于miR-NC+CVB3组,TNF-α、IL-1β的含量及IRAK-1、TRAF-6的表达水平均低于miR-NC+CVB3组;过表达miR-146a-5p时,野生型IRAK-1、TRAF-6报告基因的荧光活力低于miR-NC组。以上结果表明CVB3感染的胰岛β细胞中多种miRNAs表达发生变化,其中miR-146a-5p表达降低与CVB3感染引起胰岛β细胞损伤有关,靶向IRAK-1、TRAF-6并调控炎症反应是可能的分子机制。本研究对CVB3感染引起胰岛素β细胞损伤的作用及分子机制进行了初步探究,进而为今后阐明1型糖尿病的发病机制及防治靶点提供了依据。

B3型柯萨奇病毒上调NF-κB引起胰岛β细胞凋亡的作用及机制研究

B3型柯萨奇病毒(Coxsackie virus B3,CVB3)与1型糖尿病发病、胰岛功能破坏有关,但CVB3对胰岛β细胞凋亡的影响及机制尚不清楚。本研究的目的是观察CVB3上调NF-κB p-p65引起胰岛β细胞凋亡的作用及机制,进而初步探究CVB3感染引起胰岛β细胞损伤的分子机制。本研究培养了人胰岛β细胞株,分为对照组、CVB3组、阴性对照(NC)质粒组、NF-κB p65质粒组、si-NC组、si-NC+CVB3组、si-NF-κB p65+CVB3组,检测细胞活力A490水平、细胞凋亡率及细胞中cleaved caspase-3、NF-κB p-p65、IκBα的表达水平。结果显示与对照组比较,CVB3组的A490水平及细胞中IκBα的表达水平降低,细胞凋亡率及细胞中cleaved caspase-3、NF-κB p-p65的表达水平增加(P<0.05);与NC质粒组比较,NF-κB p65质粒组的A490水平降低,细胞凋亡率及细胞中cleaved caspase-3、NF-κB p-p65的表达水平增加(P<0.05);与si-NC+CVB3组比较,si-NF-κB p65+CVB3组的A490水平增加,细胞凋亡率及细胞中cleaved caspase-3、NF-κB p-p65的表达水平降低(P<0.05)。以上结果表明CVB3感染能够促进胰岛β细胞凋亡,这一促凋亡作用与上调NF-κB有关。本文的创新在于探讨了NF-κB参与CVB3感染引起胰岛β细胞凋亡的过程,表明CVB3感染通过上调NF-κB引起胰岛β细胞凋亡,进而参与1型糖尿病的发病。

柯萨奇B组3型病毒SYBR GreenⅠRT-PCR检测方法的建立

目的建立一种灵敏、特异的柯萨奇B组3型(CV-B3)病原SYBR GreenⅠRT-PCR实时荧光定量检测方法,用于快速、准确地检测CV-B3。方法设计柯萨奇B组病毒通用引物以及VP1基因的T7启动子特异性引物,以体外转录获得的RNA为标准品,绘制标准曲线,建立CV-B3的荧光定量PCR检测方法;对检测方法的敏感度、特异性、重复性进行评价。结果该检测方法在10~10^(9)拷贝/微升范围内具有良好的扩增效率和线性关系,最低检测限为10拷贝/微升,标准曲线r^(2)=0.999,扩增效率为95.7%;且对柯萨奇病毒A组6型(CV-A6)、柯萨奇病毒A组10型(CV-A10)、肠道病毒71型(EV-71)均无交叉反应,重复性实验变异系数(CV%)<2%。结论本实验建立的检测方法敏感度较高,同时具备良好的特异性及重复性,可用于CV-B3病原的临床及实验室样本的定性定量检测。

黄芪甲苷对柯萨奇B组3型病毒感染乳鼠心肌细胞及病毒性心肌炎乳鼠心肌细胞的修复作用观察

目的观察黄芪甲苷(Astragaloside Ⅳ,AsⅣ)对柯萨奇B组3型病毒(coxsackie virus B3,CVB3)感染的乳鼠心肌细胞和病毒性心肌炎(VMC)乳鼠心脏的修复作用,并探讨其可能作用机制。方法 ①分离培养原代乳鼠心肌细胞,测算AsⅣ对乳鼠心肌细胞的最大无毒浓度(TC0),取乳鼠心肌细胞分为正常对照组、病毒对照组、AsⅣ组。病毒对照组和AsⅣ组分别用1000 TCID50的CVB3病毒感染心肌细胞。AsⅣ组分为五个亚组,细胞长至单层细胞时,分别加入20、10、5、2.5、1.25 mg/L的AsⅣ,当病毒对照组中75%以上的细胞出现病变时结束培养。 MTT法观察各组细胞存活情况(以OD值表示),收集各组细胞上清液,全自动生化分析仪检测乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CK-MB)含量。②75只小鼠分为正常对照组、模型对照组、AsⅣ高剂量组、AsⅣ中剂量组、AsⅣ低剂量组,每组15只。除正常对照组外,其余各组小鼠均腹腔注射1000 TCID50的 CVB3病毒液0.1 mL/只,建立VMC动物模型。接种病毒24 h时,AsⅣ高、中、低剂量组分别给予4、2、1 g/kg的AsⅣ灌胃,正常对照组、模型对照组每日予0.5%羧甲基纤维素钠20 mL/kg灌胃,各组均灌胃7 d,灌胃第8 d脱颈椎处死小鼠,取心肌组织,观察心肌组织病理学变化,全自动生化分析仪检测各组小鼠血清中LDH、CK-MB含量。结果与空白对照组比较,病毒对照组及AsⅣ组各亚组细胞OD值降低( P 均<0.05);与病毒对照组比较,及AsⅣ组各亚组细胞OD值降低( P 均<0.05)。与正常对照组比较,病毒对照组心肌细胞LDH、CK-MB含量升高( P 均<0.05);与病毒对照组比较,10、20 mg/L的AsⅣ组心肌细胞LDH、CK-MB含量降低( P 均<0.05)。与空白对照组比较,病毒对照组心肌组织排列紊乱,淋巴细胞和单核细胞出现介导的炎性浸润、心肌细胞出现明显出血水肿甚至坏死。AsⅣ组不同剂量心肌组织排列紊乱情况轻,淋巴细胞和单核细胞出现介导的炎性浸润、心肌细胞轻微出血水肿,心肌组织坏死以点状炎症和坏死灶为主。与空白对照组比较,模型对照组心肌细胞LDH、CK-MB含量升高( P 均<0.05);与模型对照组比较,AsⅣ高、中、低剂量组心肌细胞LDH、CK-MB含量降低( P 均<0.05)。结论 AsⅣ对CVB3感染的心肌细胞和VMC乳鼠心肌细胞均具有明显的保护作用,其机制可能为AsⅣ降低LDH、CK-MB含量。

柯萨奇病毒B3型3D蛋白抗体的制备

肠道病毒3D蛋白是其RNA聚合酶。柯萨奇病毒B3型(coxsackievirus B3,CVB3)主要感染心脏,其3D蛋白在心肌表达中的时序和分布尚不清楚。本研究将通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)获得的CVB 3D片段插入pET28a(+)的表达框,获得pET28a(+)-3D重组质粒。异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导pET28a(+)-3D表达3D-His蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)后,切胶,获得3D-His蛋白。3D-His蛋白加佐剂免疫新西兰大白兔制备3D蛋白多克隆抗体,蛋白免疫印迹法检测抗体效价及特异性。结果显示,本研究获得了高效价且特异性好的抗CVB3 3D蛋白抗体,可用于CVB3 3D蛋白功能的后续研究。

柯萨奇病毒B组3型基因组剪切片段的序列分析

柯萨奇病毒B组(Coxsackievirus B,CVB)感染细胞时其基因组RNA存在不稳定现象,但产生机制尚不清楚。本研究将柯萨奇病毒B组3型(CVB3)感染细胞后,利用5′cDNA末端快速扩增技术(5′rapid amplification of cDNA ends,5′RACE)扩增并克隆细胞内CVB3基因组片段,并对每条序列及其5′端的二级结构进行分析。结果获得的20条CVB3基因组片段,长度为2067~5547bp,片段断端主要分布于2Apro和2C编码区。RNAfold分析显示,这些片段多数在5′断点端形成二级茎-环结构。本研究显示,CVB在宿主细胞感染时可形成大量不完整基因组RNA片段,这些片段可在5′断点端形成局部双链结构,提示片段不是随机产生,可能是RNA酶剪切产物。此发现有助于理解CVB基因组不稳定的机制。