TGFα/EGFR通路相关蛋白在B6-Co小鼠眼睑中的表达

目的研究转化生长因子α(transforming growth factorα,TGFα)/表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)通路相关蛋白在B6-Co胎鼠眼睑中的表达情况,探讨B6-Co小鼠眼睑发育异常的原因。方法取胚胎16.5 d、17.5 d、18.5 d的B6和B6-Co胎鼠头部,做冰冻切片,通过免疫荧光法检测各时间点TGFα在眼睑部位的原位表达情况;提取蛋白,采用Western blot法检测TGFα表达及EGFR、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)磷酸化蛋白表达情况。结果免疫荧光检测结果示,TGF氉α主要表达于眼睑间质区,3个时间点B6-Co胎鼠眼睑中TGFα表达的荧光强度均高于同一时间点在B6胎鼠眼睑中的表达。Western blot检测结果示,3个时间点B6-Co胎鼠眼睑中TGFα、p-EGFR的表达与B6胎鼠相比,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。p-ERK在胚胎16.5 d和17.5 d时,B6-Co胎鼠眼睑中的表达量分别为3.79±0.32和3.77±0.16,均显著高于在相应时间点B6胎鼠眼睑中的表达量1.48±0.11和1.45±0.07,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 TGFα/EGFR通路的下游因子ERK可能是导致B6-Co小鼠眼睑异常发育的重要因子。

不同胚期B6-Co小鼠眼睑组织中血清反应因子的表达变化

背景 C57BL/6角膜混浊表型的突变系（B6-Co）小鼠具有出生眼睑闭合不全（EOB）表型,是研究眼睑发育机制的良好动物模型.探讨血清反应因子（SRF）与B6-Co小鼠EOB表型形成的关系可为人类先天性眼睑发育缺陷产生机制的研究提供理论依据.目的 检测SRF在B6-Co小鼠胚胎眼睑发育关键时期的表达.方法 采用肌内注射戊巴比妥钠安乐死术,分别剖取B6-Co母鼠以及表型正常B6母鼠体内胚胎期（E）16.5 d、E17.5 d和E18.5 d小鼠各9只,分离眼睑组织,分别采用实时定量PCR法和Western blot法检测小鼠眼睑组织中SRF mRNA及其蛋白的相对表达水平.取各胎龄的B6-Co小鼠和B6小鼠制作组织冰冻切片,利用免疫荧光技术检测并比较2种小鼠SRF在眼睑组织中的定位和表达强度.结果 B6-Co小鼠E16.5 d和E17.5 d眼睑组织中SRF mRNA的相对表达水平分别为0.41±0.06和0.24±0.17,明显低于B6小鼠的1.03±0.17和1.01±0.09,差异均有统计学意义（P=0.025、0.017）;B6-Co小鼠E16.5 d和E17.5 d眼睑组织中SRF蛋白的表达水平分别为0.08±0.01和0.08±0.01,明显低于B6小鼠的0.12±0.03和0.13 ±0.02,差异均有统计学意义（P=0.036、0.024）;而2种小鼠间E18.5 d时眼睑组织中SRF mRNA及其蛋白的表达量差异均无统计学意义（P=0.387、0.774）.免疫荧光染色显示,SRF蛋白多表达于B6-Co小鼠和B6小鼠眼睑组织的角质层细胞,但B6-Co小鼠眼睑角质形成细胞中SRF蛋白表达的荧光强度明显弱于B6小鼠.结论 SRF在B6-Co小鼠眼睑组织中的表达量明显下调,SRF可能参与眼睑发育缺陷的发生过程.

B6-Co小鼠Ankrd55和Ddx4突变候选基因克隆及测序

目的对B6-Co小鼠Ankrd55和Ddx4基因进行克隆测序分析，寻找是否存在突变位点。方法以小鼠Ankrd55和Ddx4基因的mRNA序列设计引物，以mRNA为模板，采用RT-PCR和PCR技术分段进行目的基因扩增，将目的片段连接在T载体上，转化至感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒DNA分子，电泳检测，EcoRE酶切释放目的片段，测序、分析、比对。结果Ddx4基因位于小鼠13号染色体第113412349的碱基由c转换成A，导致编码氨基酸的密码子改变，产物脯氨酸（P）变成谷氨酰胺（Q）。结论Ddx4基因发生单碱基突变，表明该突变可能与B6－co小鼠的EOB表型相关，但是有待于进一步研究。

Hspa5和E-cadherin在B6-Co小鼠胚胎后期眼睑中的表达研究

目的:检测遗传性角膜混浊突变系小鼠(B6-Co)与B6小鼠在胚胎后期眼睑组织中Hspa5、E-cadherin基因及蛋白的表达变化,探讨两者与B6-Co小鼠EOB表型形成的内在联系。方法:取B6、B6-Co胚胎期16.5天(E16.5d)、E18.5d小鼠眼睑,用Realtime PCR法和Western Blot法检测眼睑中Hspa5、E-cadherin的m RNA和蛋白表达情况。结果:E16.5d,B6-Co小鼠眼睑中Hspa5表达显著降低,E-cadherin表达显著升高;E18.5d,B6-Co小鼠Hspa5表达显著升高,E-cadherin表达显著降低。结论:Hspa5、E-cadherin的基因和蛋白在B6-Co突变系小鼠眼睑中的表达出现明显异常,提示B6-Co小鼠胚胎发育后期Hspa5、E-cadherin表达变化与EOB表型的形成有密切关联。