共表达人B7—1和HGF／NK4基因的重组腺病毒的制备及初步鉴定

目的构建能同时表达B7—1和HGF／NK4基因的重组腺病毒载体，同时制备相应的复制缺陷型重组腺病毒，检测其在喉癌细胞中的表达。方法构建以串联方式携带人B7-1和HGF／NK4基因的重组穿梭载体pAdtrack-NK4-B7-1。Pme I线性化后与腺病毒载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183，通过同源重组得到重组腺病毒载体pAd—NK4-B7—1。将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒，应用病毒悬液感染人喉癌细胞株。用RT-PCR检测感染细胞中B7-1和NK4基因mRNA表达。结果酶切鉴定证实阳性pAdTrack—NK4-B7—1重组穿梭载体含有目的基因B7-1和HGF／NK4，同源重组后制备的病毒载体DNA经酶切鉴定获得了阳性重组腺病毒载体，该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装，转染3d后可以观察到绿色荧光蛋白（GFP）表达并逐渐增多、增强。制备的Ad—NK4-B7在体外能有效感染Hep-2细胞，感染后可维持6d高水平的B7—1和NK4基因的表达，整体表达可持续2周。结论成功构建了同时表达B7．1和NK4基因的重组腺病毒载体并制备出重组腺病毒颗粒，该病毒能有效地感染喉癌细胞并表达高水平的NK4和B7-1基因，为进一步研究B7—1和NK4基因的功能及应用B7—1和NK4进行喉癌的联合基因治疗提供了依据和素材。

早期胃癌患者血清TK1、STAT1、sB7-H4水平变化及对内镜黏膜下剥离术预后的预测价值

目的 探究早期胃癌患者血清胸苷激酶1(TK1)、信号转导和转录活化因子1(STAT1)、可溶性B7-H4(sB7-H4)水平变化,并分析其对内镜黏膜下剥离术(ESD)预后的预测价值。方法 前瞻性选取2019年1月至2022年7月郑州大学第一附属医院300例接受ESD手术的早期胃癌患者,检测围手术期(术前、术后3 d、术后7 d)血清TK1、STAT1、sB7-H4水平,术后接受为期1 a随访,根据有无复发分为复发组(22例)与未复发组(278例)。比较两组患者的临床资料及血清TK1、STAT1、sB7-H4水平。评价血清TK1、STAT1、B7-H4水平预测早期胃癌患者ESD术后复发的价值。结果 所有患者术后7 d血清TK1、sB7-H4水平<术后3 d<术前(P<0.05),所有患者术后7 d血清STAT1水平>术后3 d>术前(P<0.05)。复发组术后3、7 d的血清TK1、sB7-H4水平均高于未复发组,STAT1水平均低于未复发组(P<0.05)。术后3、7 d血清TK1、sB7-H4、STAT1联合预测复发的曲线下面积(AUC)分别为0.901、0.944,均大于各时间点三项血清指标单独预测,且术后7 d预测价值更高,此时最佳敏感度、特异度分别为90.91%、86.33%。结论 血清TK1、sB7-H4、STAT1水平变化与早期胃癌患者ESD术后复发密切相关,且在临床早期预测患者术后复发方面具有较高预测效能。

血清Pannexin1、TSP-1、sB7-H3水平与急性脑梗死患者丁苯酞治疗效果的关系

目的探讨血清泛连接蛋白1(Pannexin1)、血小板反应蛋白-1(TSP-1)、可溶性共刺激分子B7-H3(sB7-H3)水平与急性脑梗死(ACI)患者丁苯酞治疗效果的关系。方法选取2021年3月至2022年3月新乡医学院第一附属医院收治的140例急性脑梗死患者作为ACI组,同期行健康体检的健康志愿者100例作为健康组。检测所有研究对象血清Pannexin1、TSP-1、sB7-H3表达水平,分析三者与ACI患者临床特征的关系。ACI患者入院后均使用丁苯酞治疗,分析治疗前后血清Pannexin1、TSP-1、sB7-H3表达差异,并根据治疗效果不同分为治疗有效组(n=91)与治疗无效组(n=49),比较两组血清Pannexin1、TSP-1、sB7-H3水平,明确与患者治疗效果的关系及预测价值。结果ACI组血清Pannexin1、TSP-1、sB7-H3表达水平均高于健康组,差异有统计学意义(P<0.05)。疾病重度、大面积梗死、颈动脉重度狭窄ACI患者血清Pannexin1、TSP-1、sB7-H3处于较高水平(P<0.05)。治疗后,ACI患者使用丁苯酞血清Pannexin1、TSP-1、sB7-H3表达水平均低于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗无效组患者血清Pannexin1、TSP-1、sB7-H3表达水平高于治疗有效组,差异有统计学意义(P<0.05)。血清Pannexin1、TSP-1、sB7-H3水平与ACI患者丁苯酞治疗效果均表现为正相关关系,差异有统计学意义(r=0.453、0.425、0.466,P<0.05)。Logistic回归分析显示,除受疾病程度、梗死面积、颈动脉狭窄程度的影响外,Pannexin1、TSP-1、sB7-H3同样是影响ACI患者丁苯酞治疗效果的危险因素,差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线显示,血清Pannexin1、TSP-1、sB7-H3三项联合曲线下面积为0.934显著高于三项单独预测,且敏感度、特异度均较高。结论Pannexin1、TSP-1、sB7-H3在ACI患者血清中表达升高,且与患者丁苯酞治疗效果有关,临床可通过早期监测血清Pannexin1、TSP-1、sB7-H3水平早期预测治疗效果,以改善患者预后。

可溶性共刺激分子sPD-L1、sB7-H3、sB7-H4在结直肠癌患者血清中的表达水平及临床意义分析

目的探讨可溶性共刺激分子[可溶性程序性细胞死亡蛋白配体1(sPD-L1)、可溶性B7同源体3(sB7-H3)、可溶性B7同源体4(sB7-H4)]在结直肠癌患者血清中的表达情况,及其与患者临床病理参数的关系及预后评估价值。方法酶联免疫吸附试验法检测68例结直肠癌组血清sPD-L1、sB7-H3、sB7-H4表达水平,并与良性病变组及健康对照组进行比较,同时分析其与患者病理参数的关系。结果结直肠癌组sB7-H3表达水平为(9.128±0.509)ng/mL,良性病变组和健康对照组sB7-H3表达水平分别为(7.029±0.293)、(6.701±0.373)ng/mL,差异有统计学意义(P<0.05)。受试者工作特征曲线分析显示sB7-H3曲线下面积为0.6805(95%CI:0.5848~0.7761),P=0.0010。与肿瘤最大径<5 cm、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移患者比较,肿瘤最大径≥5 cm、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移患者血清sB7-H3表达水平显著增高。sB7-H4水平则与患者TNM分期及有无淋巴结转移显著相关(P=0.0372、0.0078);与TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移患者比较,TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移的患者血清sB7-H4表达水平明显增加。结论结直肠癌患者血清sB7-H3表达水平显著升高,在结直肠癌疾病诊断中具有潜在的临床应用价值;患者血清sB7-H3与sB7-H4水平与患者的TNM分期及是否淋巴结转移有显著相关,可作为结直肠癌进展与预后判断的潜在分子标志。

分子佐剂C3d上调Raji细胞协同刺激分子B7-1和B7-2的表达(简报)

我们在以往研究中，引入选择性增强体液免疫效应的新型分子佐剂C3d，成功构建了重组避孕疫苗hCGβ-C3d3，通过免疫Th2型优势的BALB／c小鼠和Th1型优势的C57BL／6小鼠．显示分子佐剂C3d在不同品系小鼠均使免疫效应从Th1型细胞免疫向Th2型体液免疫偏倚。

B7-1与CD40L在淋巴瘤免疫治疗中的协同作用

为了研究B7-1与CD40L共刺激途径在淋巴瘤的免疫治疗中的作用,探讨治疗淋巴瘤疫苗有效的作用方式,将A20淋巴瘤细胞株接种在BALB/c小鼠身上以构建荷瘤小鼠模型,将B7-1与CD40L表达载体单独或联合导入肿瘤内,以PBS和空载体作为对照,观察肿瘤生长的情况;应用肿瘤病理切片和HE染色技术观察肿瘤组织形态及淋巴细胞浸润情况,采用CCK-8试剂盒检测荷瘤小鼠脾CTL杀伤效应。结果显示,瘤内注射B7-1或CD40L表达载体可导致肿瘤生长延缓或体积缩小,两者联合注射较对照组和单独注射组的肿瘤消退效应明显增强。肿瘤形态学观察表明,治疗小鼠肿瘤局部有炎性细胞浸润并伴有大面积的坏死,肿瘤局限化;CCK8试剂盒检测显示小鼠脾CTL杀伤能力增强。结论:B7-1与CD40L疫苗对淋巴瘤具有治疗效应,两者联合治疗的效果优于单一治疗。质粒载体瘤内注射可作为一种安全有效的肿瘤疫苗作用方式。

逆转录病毒载体介导大鼠乳腺癌细胞共表达MIP-1α和B7-1

目的:建立共表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的大鼠乳腺癌细胞株,并进行体外活性检测。方法:应用含不同选择标记的重组逆转录病毒载体,经1mg/mlG418和2μg/ml puromycin双药物筛选后获得MIP-1α+B7-1基因共表达的大鼠乳腺癌细胞株。RT-PCR、免疫组化检测mMIP-1α的表达,RT-PCR、流式细胞术检测mB7-1的表达;将共表达MIP-1α和B7-1的肿瘤细胞与大鼠脾淋巴细胞混合培养后,MTT法检测淋巴细胞的增殖指数、琼脂糖打孔法检测共表达MIP-1α和B7-1肿瘤细胞对单个核细胞的趋化活性。结果:经脂质体转染包装细胞产生的重组逆转录病毒上清病毒滴度达4.6×107CFU/L。细胞生长曲线显示,重组逆转录病毒感染对乳腺癌细胞增殖无明显影响。重组逆转录病毒感染的大鼠乳腺癌细胞株SHZ-88/mMIP-1α+mB7-1有B7-1和MIP-1α mRNA及蛋白的表达。淋巴细胞增殖指数PI值SHZ-88/PLXSN组为(0.76±0.25),SHZ-88/mMIP-1α+mB7-1组为(1.95±0.31),后者体外刺激淋巴细胞增殖能力增强(P<0.01),SHZ-88/pBabe puro组的趋化指数为(0.99±0.19),mMIP-1α+mB7-1组的为(3.88±0.33),后者显著增强了趋化活性。结论:通过逆转录病毒载体介导建立MIP-1α和B7-1基因共表达的大鼠乳腺癌细胞株具有招引单个核细胞,并将其激活的体外生物学活性。

移植肾组织中共刺激分子B7-1及相关蛋白的表达研究

目的研究尸体移植肾组织中共刺激分子B7-1及HLA-DR的表达规律,探讨阻断共刺激途径诱导免疫耐受在预防和治疗肾移植术后排斥反应中的应用。方法应用免疫组化ABC法检测56例尸体移植肾及5例正常供肾组织中B7-1及其相关蛋白的表达情况。结果急性排斥组移植肾组织中B7-1及HLA-DR强烈表达,并伴有大量CD+4及CD+8T细胞的浸润,与其余各组比较具有显著性差异(P<0.01)。结论在发生移植排斥反应时,肾小管上皮细胞等作为抗原提呈细胞,主动表达B7-1,为T淋巴细胞的活化提供了协同刺激信号;通过阻断共刺激途径诱导移植免疫耐受,为寻找新型免疫抑制剂提供了理论基础。

B7-1抗体阻断B7/CD28信号通路对Pristane肾病的治疗作用

目的:探讨B7-1抗体阻断B7-1/CD28信号通路对小鼠Pristane肾病的治疗作用。方法:将8周龄雌性C57BL/J6小鼠随机分为3组,正常对照组予生理盐水0.5ml/只,造模组与治疗组予Pristane0.5ml/只后,分别予鼠同型IgG抗体(造模组)或鼠抗人B7-1抗体(治疗组)200μg/只,第10天分别检测局部淋巴结和脾脏中吞噬细胞、树突状细胞的活化及脾脏B细胞表面活化分子的变化;每月定期检测血清中抗核抗体(ANA)及尿蛋白,七个月后处死动物H&E染色观测肾脏病理变化和冰冻切片直接免疫荧光法观察免疫复合物(IC)的沉积情况。结果:第10天,相对于正常对照组、治疗组和造模组小鼠局部淋巴结和脾脏中吞噬细胞、树突状细胞均有不同程度的活化,治疗组活化程度明显低于造模组(P<0.05),脾脏B细胞表面CD21、CD40、CD86等分子上调程度低于造模组(P<0.05);4个月后治疗组和造模组小鼠血清均检测到ANA,但治疗组的血清抗体滴度较造模组低(P<0.05);治疗组7个月后,尿蛋白含量低于造模组,肾脏H&E结果显示治疗组小鼠肾脏病理改变轻于造模组,直接免疫荧光检测可见治疗组免疫复合物荧光强度弱于造模组,正常对照组小鼠肾脏没有明显的病理改变。结论:鼠抗人B7-1抗体对Pristane肾病具有一定的治疗效果。

B7-1基因转染骨肉瘤细胞诱导抗骨肉瘤主动免疫的实验研究

目的:探讨B7-1基因转染骨肉瘤细胞能否诱导抗骨肉瘤主动免疫作用。方法:利用脂质体将B7-1真核表达载体pcDNA3-B7-1和空载体pcDNA3分别导入骨肉瘤细胞株LM8中,G418筛选出阳性克隆(分别命名为LM8/B7-1和LM8/pcDNA3),通过RT-PCR、Western blot和流式细胞仪检测B7-1基因与蛋白的表达;通过软琼脂克隆形成实验观察转基因细胞株LM8/B7-1的体外增殖能力;用LM8、LM8/B7-1和LM8/pcDNA3分别经腹腔免疫小鼠,得到腹腔浸润淋巴细胞和致敏脾细胞,MTT法检测其体外杀伤活力;将LM8、LM8/B7-1和LM8/pcDNA3细胞分别接种到C3H雄性小鼠前腋下,观察其致瘤能力;观察LM8/B7-1致敏的小鼠对骨肉瘤细胞LM8是否具有免疫保护作用。结果:B7-1基因在转基因细胞LM8/B7-1中能得到高表达;LM8/B7-1体外增殖能力与LM8和LM8/pcDNA3无明显差异(P>0.05);LM8/B7-1诱导的CTL的杀伤活力显著高于LM8和LM8/pcDNA3诱导的CTL对相同靶细胞的杀伤活力,LM8/B7-1诱导的CTL对LM8/B7-1的杀伤活力也明显高于对LM8和LM8/pcDNA3的杀伤活力(P<0.05);LM8/B7-1致瘤能力较LM8和LM8/pcDNA3细胞明显下降(P<0.01);LM8/B7-1致敏的小鼠对骨肉瘤细胞LM8具有免疫保护作用。结论:B7-1基因转染骨肉瘤细胞能诱导抗骨肉瘤主动免疫作用,为利用B7-1基因进行骨肉瘤免疫基因治疗提供了实验依据。

4株鼠抗人B7-1分子单抗的制备及其生物学活性的鉴定

目的 :制备鼠抗人B7 1分子 (mAb)单抗及研究其生物学活性。方法 :以人多发性骨髓瘤细胞转人B7 1基因细胞株XG7 B7为免疫原 ,采用B淋巴细胞杂交瘤技术制备鼠抗人B7 1分子单抗 ;以Westernblot及间接免疫荧光标记法鉴定其特异性和亲和力 ;采用3H TdR掺入实验和Annexin V染色分析测定该单抗的生物学功能。结果 :获得了 4株持续分泌抗人B7 1分子的特异性单抗的杂交瘤细胞株 ,分别命名为 1F11、3H8、6H2和 7B10 ,其分泌的单抗类别分属于小鼠IgG1和IgM ;4株单抗均具有良好的特异性和亲和力 ;1F11、3H8和 6H2能部分阻断B7 1分子基因转导细胞介导的共刺激信号 ,从而抑制T细胞的增殖效应 (抑制率 2 1%～ 5 2 % ) ;且能诱导天然表达B7 1分子的人B系淋巴瘤细胞Raji的凋亡。结论 :成功研制 4株功能性抗人B7 1分子抗体 ,这些抗体在抗异体组织器官移植排斥反应及在B系淋巴瘤的治疗中具有潜在的应用价值。

超声血流参数变化与卵巢癌患者临床分期及血清B7H4、TK-1的关系

目的分析超声血流参数变化与卵巢癌患者临床分期及血清B7同源体4(B7H4)、胸苷激酶-1(TK-1)的关系。方法选取2020年10至2022年10月在武汉市汉阳医院和武汉亚心总医院接受治疗的86例卵巢癌患者作为卵巢癌组,根据国际妇产科联盟(FIGO)卵巢癌分期标准分期:Ⅰ+Ⅱ期40例,Ⅲ+Ⅳ期46例;选取同期同一医院43例卵巢良性肿瘤患者作为良性组。患者均行彩色多普勒超声检查,获得血管搏动指数(PI)、收缩期峰值流速(PSV)、阻力指数(RI)、舒张末期流速(EDV)参数;采用酶免疫点印迹化学发光法检测血清TK-1水平;采用酶联免疫吸附试验法检测血清B7H4水平。采用Pearson相关性分析卵巢癌患者血清B7H4、TK-1水平与PI、RI、PSV、EDV之间的相关性。结果卵巢癌组血清B7H4、TK-1水平高于良性组,超声血流参数PI和RI低于良性组,PSV和EDV高于良性组(P<0.05)。Ⅲ+Ⅳ期卵巢癌患者血清B7H4、TK-1水平高于Ⅰ+Ⅱ期卵巢癌患者(P<0.05),PI和RI低于Ⅰ+Ⅱ期卵巢癌患者,PSV和EDV高于Ⅰ+Ⅱ期卵巢癌患者(P<0.05)。Pearson相关分析显示,卵巢癌患者血清B7H4、TK-1水平与PI、RI均呈负相关(P<0.05),与PSV、EDV均呈正相关(P<0.05)。结论血清B7H4、TK-1水平在卵巢癌患者中高表达,其表达水平与超声血流参数有关,可用于评估患者病情发展程度。

MSCT联合血清sB7-H4、YKL-40诊断胃癌淋巴结转移的临床价值

目的探讨多层螺旋CT(MSCT)联合血清可溶性B7-H4(B7-H4)、甲壳质酶蛋白40(YKL-40)对胃癌淋巴结转移的诊断价值。方法选取2021年1月至2023年1月确诊的胃癌患者114例,根据患者是否发生淋巴结转移分为转移组54例和未转移组60例,对患者进行MSCT检查,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清sB7-H4、YKL-40水平;受试者工作特征(ROC)曲线分析血清sB7-H4、YKL-40水平对胃癌淋巴结转移的诊断价值;采用Kappa一致性检验分析各方法与病理结果一致性。结果转移组血清sB7-H4、YKL-40水平及强化程度显著高于未转移组(P<0.05)。血清sB7-H4、YKL-40水平诊断胃癌淋巴结转移的曲线下面积(AUC)分别为0.794、0.811。MSCT、血清sB7-H4、YKL-40单独及联合检查与病理结果一致性分别为较高、中度、中度、极高,Kappa值分别为0.721、0.473、0.408、0.859(P<0.05)。MSCT联合血清sB7-H4、YKL-40诊断胃癌淋巴结转移的特异度、阳性预测值显著高于三者单独诊断,准确度、阴性预测值显著高于血清sB7-H4、YKL-40单独诊断,敏感度高于血清sB7-H4单独诊断(P<0.05)。结论MSCT联合血清sB7-H4、YKL-40对于诊断胃癌淋巴结转移有较高的应用价值。

表达小鼠B7-1基因的重组逆转录病毒载体构建及真核表达

目的:构建表达小鼠B7-1基因的重组逆转录病毒载体并在真核细胞中检测其蛋白表达。方法:PCR法获基因,定向克隆连接到逆转录病毒载体上,得到重组逆转录病毒载体,酶切法鉴定,真核细胞中检测蛋白表达。结果:酶切所得片段与所需相符,在真核细胞中检测到蛋白表达。结论:成功构建重组的逆转录病毒载体,为今后研究奠定了基础。

不可复性牙髓炎患者血清可溶性B7-H3、CX3趋化因子受体1水平变化及其临床意义

目的检测不可复性牙髓炎患者可溶性B7-H3(sB7-H3)、CX3C趋化因子受体1(CX3CR1)水平变化,探讨二者在预后中的评估价值。方法选取104例不可复性牙髓炎患者为病例组,其中急性牙髓炎52例、慢性牙髓炎52例,根据治疗结果分为预后好组83例和预后差组21例;选同期体检健康者101例为健康组。采用酶联免疫吸附法检测血清sB7-H3、CX3CR1水平。结果病例组血清sB7-H3、CX3CR1水平高于健康组(P<0.05)。急性牙髓炎患者血清sB7-H3、CX3CR1水平高于慢性牙髓炎患者(P<0.05)。预后差组治疗前后血清sB7-H3、CX3CR1水平高于预后好组(P<0.05);血清sB7-H3、CX3CR1水平不同时间、组间及交互作用比较,差异有统计学意义(P<0.05)。预后差组病情为急性的患者比例高于预后好组(P<0.05)。sB7-H3、CX3CR1是不可复性牙髓炎患者预后差的独立影响因素(P<0.05)。结论不可复性牙髓炎患者血清sB7-H3、CX3CR1水平升高,二者可能成为评估不可复性牙髓炎病情及治疗效果的重要指标。

Wilms瘤基因1、B7家族成员H3及自然杀伤细胞表面受体在多发性骨髓瘤和淋巴瘤中的表达及临床意义

目的探讨Wilms瘤基因1(WT1)、B7家族成员H3(B7H3)及自然杀伤(NK)细胞表面受体在多发性骨髓瘤和淋巴瘤中的表达及临床意义。方法选取56例多发性骨髓瘤患者和50例淋巴瘤患者,分别作为骨髓瘤组和淋巴瘤组,采用流式细胞仪检测两组患者NK细胞占有核细胞比例,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测两组患者WT1、B7H3 mRNA相对表达量以及NK细胞表面受体NKG2D、CD69、程序性死亡受体1(PD-1)mRNA的相对表达量。随访1年,比较不同预后情况多发性骨髓瘤和淋巴瘤患者WT1、B7H3 mRNA相对表达量及NK细胞占有核细胞比例。绘制受试者工作特征(ROC)曲线,计算曲线下面积(AUC),评估各指标对多发性骨髓瘤患者和淋巴瘤患者预后的预测价值。结果骨髓瘤组患者B7H3 mRNA相对表达量低于淋巴瘤组,PD-1、NKG2D mRNA相对表达量及NK细胞占有核细胞比例均高于淋巴瘤组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。随访结束,56例多发性骨髓瘤患者中,预后不良15例,预后良好41例,预后良好的多发性骨髓瘤患者B7H3 mRNA相对表达量明显低于预后不良患者,差异有统计学意义(P﹤0.01)。B7H3预测多发性骨髓瘤患者预后的AUC为0.748(95%CI:0.605~0.891),cut-off值为3.29,此时的灵敏度为0.867,特异度为0.659。随访结束,淋巴瘤组患者中,预后不良19例,预后良好31例,预后良好淋巴瘤患者B7H3 mRNA相对表达量低于预后不良患者,NK细胞占有核细胞比例高于预后不良患者,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。B7H3、NK细胞占有核细胞比例联合检测预测淋巴瘤患者预后的AUC为0.852(95%CI:0.731~0.973),灵敏度为0.871,特异度为0.737。结论B7H3及NK细胞受体在多发性骨髓瘤和淋巴瘤患者中的表达水平存在差异,但WT1水平的差异不明显,B7H3及NK细胞占有核细胞比例对多发性骨髓瘤及淋巴瘤患者的预后有一定的预测意义。

转染MIP-1α和B7-1基因增强小鼠的抗淋巴瘤效应

目的观察转染趋化因子MIP-1α和共刺激分子B7-1基因增强小鼠抗淋巴瘤的效应。方法将MIP-1α和B7-1基因慢病毒重组载体转染小鼠EL-4淋巴瘤细胞,应用RT-PCR检测MIP-1α和B7-1基因mRNA表达,Western blot法检测MIP-1α和B7-1蛋白表达;转基因EL-4细胞注入小鼠右腋皮下,观察成瘤情况;灭活的转基因EL-4细胞注入成瘤小鼠体内,观察其增强小鼠抗淋巴瘤效应。结果 RT-PCR检测发现EL-4/MIP-1α+B7-1细胞内有MIP-1α及B7-1mRNA表达,Western blot显示MIP-1α及B7-1蛋白表达;MIP-1α组、B7-1组较对照组成瘤时间延长,成瘤率降低,肿瘤平均体积较小,而联合组成瘤性消失;MIP-1α和B7-1治疗组的肿瘤平均体积、重量及肿瘤器官转移率明显小于对照组(P<0.05),而联合组的肿瘤平均体积及重量明显小于MIP-1α和B7-1组(P<0.05),而且联合组小鼠平均生存期,均较单基因组、对照组明显延长(P<0.05)。结论转染MIP-1α和B7-1基因能够明显增强小鼠机体抗淋巴瘤效应,明显延长荷瘤小鼠的平均生存期,为淋巴瘤的基因治疗提供了新的思路。

小鼠B7-1和B7-2基因转染EL4细胞瘤苗抗肿瘤免疫作用的比较研究

目的:比较小鼠免疫共刺激信号B7-1和B7-2转化小鼠淋巴瘤细胞株EL4后,转化细胞介导的抗肿瘤免疫作用。方法:构建逆转录病毒表达载体pLXSN-mB7-1和pLXSN-mB7-2,转染野生型EL4细胞,获得高表达B7-1和B7-2分子的EL4/mB7-1和EL4/mB7-2细胞,并制备成瘤苗;分别应用LDH释放法、MTT法以及ELISA法检测比较两种瘤苗激活的T细胞的杀伤活性、细胞增殖和IL-2的分泌情况。结果:①EL4/mB7-1和EL4/mB7-2瘤苗刺激小鼠脾脏T淋巴细胞分泌IL-2的量明显超过野生型EL-4细胞(P<0.01);②24 h,EL4/mB7-1瘤苗刺激小鼠脾脏T淋巴细胞分泌的IL-2的量超过EL4/mB7-2瘤苗(P<0.05);48 h,EL4/mB7-2瘤苗刺激小鼠脾脏T淋巴细胞分泌IL-2的量超过EL4/mB7-1瘤苗(P<0.05);③EL4/mB7-1瘤苗和EL4/mB7-2瘤苗刺激小鼠T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的活性明显增强。EL4/mB7-2瘤苗刺激小鼠T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的活性与EL4/mB7-1瘤苗相当(P>0.05)。结论:mB7-1和mB7-2分子可活化T细胞分泌IL-2,两者刺激T细胞产生IL-2的高峰时间不同。mB7-2刺激T细胞产生CTL的杀伤活性与mB7-1无明显差别。

人B7-1转基因肝癌瘤苗的实验研究

用逆转录病毒转移体系建立表达人B7-1(hB7-1)的肝癌瘤苗,瘤苗与外周血淋巴细胞(PBLs)或T细胞共同孵育,观察该瘤苗激活T淋巴细胞的能力。发现所建立的hB7-1转基因肝癌瘤苗可有效刺激PBLs或T细胞增殖并产生特异性免疫反应。认为hB7-1转基因肝癌瘤苗可能是肝癌基因治疗的有效方法之一。

反义B7—1质粒载体的构建与鉴定

目的构建反义B7—1质粒载体，为研究阻断B7—1／CD28共刺激分子通路提供基础。方法设计含有XhoI和BamHI酶切位点的1对引物，通过聚合酶链反应（PCR）技术扩增获取质粒载体pcDNA3．B7—1上的目的片段B7—1（118～530nt，426bp），克隆入PMDl8-T中间载体。PMD18-T-B7—1经XhoI和BamHI双酶切后，B7—1片段与pcDNA3B（-）连接，pcDNA3B（-）的XhoI和BamHI酶切位点与B7—1全基因序列所含酶切位点相反，构建反义B7．1表达载体。结果反义基因重组体经过酶切和PCR检测，得到426bp左有的目的基因片段。测序证明捅人的目的片段碱基序列与Genebank报道的B7-1基因序列（G1：111038144）中的B7—1片段100％同源，且反方向插入载体。结论成功构建大鼠B7—1反义真核表达载体，为阻断B7—1／CD28共刺激通路抑制排斥反应奠定了基础.