外阴鳞癌组织中DCTN2和HOXB7水平表达及与预后的价值研究

目的 探讨外阴鳞癌组织中动力蛋白激活蛋白2(dynactin2,DCTN2)和同源异型盒基因B7(homeobox gene B7,HOXB7)水平表达及与预后的价值研究。方法 收集2008年1月~2017年12月在江油市人民医院行手术治疗的132例外阴鳞癌患者的癌组织与癌旁健康组织,采用免疫组织化学法检测组织中DCTN2和HOXB7表达情况;采用Kaplan-Meier法分析外阴鳞癌患者癌组织DCTN2和HOXB7表达与五年生存率之间的关系;采用COX回归分析外阴鳞癌患者五年后生存情况的影响因素。结果 外阴鳞癌组织中DCTN2阳性表达低于癌旁健康组织(31.06%vs 71.21%),HOXB7阳性表达高于癌旁健康组织(65.91%vs 37.12%),差异具有统计学意义(χ^(2)=42.583,21.899,均P <0.05)。外阴鳞癌组织DCTN2和HOXB7表达与肿瘤FIGO分期、淋巴结转移、淋巴结转移数量、分化程度和腹股沟淋巴结情况相关(χ^(2)=16.998, 19.144;6.983, 5.800;6.595, 7.244;6.076, 5.665;5.864, 6.493,均P <0.05)。Kaplan-Meier生存曲线表明DCTN2阳性表达外阴鳞癌患者生存率高于阴性表达患者(χ^(2)=14.878,P <0.001),HOXB7阳性表达患者生存率低于阴性表达患者(χ^(2)=14.824,P <0.001)。多因素COX分析结果显示,FIGO分期、淋巴结转移、淋巴结转移数量、分化程度和HOXB7表达均是导致外阴鳞癌患者五年死亡的危险因素(P <0.05),DCTN2表达为保护因素(P <0.05)。结论 外阴鳞癌患者癌组织DCTN2表达下调,HOXB7表达升高,其表达与患者五年生存预后密切相关。

人B7-2瘤苗与DC瘤苗体外联合诱导抗食管癌的作用

目的:研究人B7-2瘤苗和负载了肿瘤细胞冻融抗原的DC瘤苗体外联合诱导抗食管癌的免疫作用.方法:应用脂质体转染技术,将融合基因表达载体pEGFP-N3-B7—2转染人食管癌细胞株EC9706.采用密度梯度离心法从脐血中分离单个核细胞(MNC)后,获得单核细胞(Mo).在细胞因子作用下诱导分化,第3d加入EC9706的冻融抗原,共培养4d后获得负载肿瘤抗原的成熟树突状细胞(MDC).将致敏DC与从脐血中分离的T淋巴细胞共培养3d,获得细胞毒T淋巴细胞(CTL);四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测CTL对转染和未转染的EC9706的细胞毒作用.结果:融合基因在食管癌细胞株EC9706的胞膜上定位表达.脐血来源的DC可负载并递呈肿瘤抗原,激活自体T淋巴细胞,诱导肿瘤特异性CTL产生,对转染pEGFP—N3-B7—2的EC9706细胞有显著杀伤作用(F=21.672,P=0.000).结论:人B7—2瘤苗和DC瘤苗体外联合应用,诱导出明显的杀伤食管癌细胞的免疫效应.

共刺激分子B7-2对小鼠肝癌治疗作用的实验研究

目的 应用转染有小鼠 B7- 2基因片段的肝癌细胞 ,建立小鼠肝癌模型 ,观察小鼠肿瘤生长和消退情况 ,研究共刺激分子 B7- 2对肿瘤的免疫治疗作用。方法 建立 BAL B/ c小鼠转 B7- 2基因肝癌细胞株 H2 2 / B7- 2 ,细胞计数法测定肿瘤细胞体外增殖能力 ;BAL B/ c鼠皮下接种 H2 2 / B7- 2及野生型 H2 2细胞 H2 2 / Wt,以空载体转染细胞 H2 2 / neo为对照 ,建立小鼠肝癌模型 ,观察小鼠成瘤期、荷瘤小鼠存活期及肿瘤结节大小 ;同源淋巴细胞肿瘤细胞混合培养 (MTL Cs)后测定淋巴细胞增殖指数和 CTLs活性 ,同时测定培养上清 IL- 2、IFNγ,研究 B7- 2分子的抗肿瘤免疫效果。结果 细胞在体外增殖能力一致 (P= 0 .782 ) ;当接种不同肿瘤细胞后 ,三组动物都发生肿瘤 ,接种 H2 2 / B7- 2组肿瘤形成有迟发性 ,并在接种 18d后肿瘤都开始缩小 ,但最终不会完全消失 ;接种 H2 2 / Wt和 H2 2 / neo组动物肿瘤都开始缩小 ,但最终不会完全消失 ;接种 H2 2 / Wt和 H2 2 /neo组动物肿瘤呈进行性生长。H2 2 / B7- 2在体外刺激淋巴细胞增殖和诱导 CTLs的能力明显强于对照细胞 (P<0 .0 5 )。结论 共刺激分子 B7- 2能增强肝癌细胞的免疫原性 ,它在抗肿瘤早期发挥作用。用其治疗肝癌是有效的 。

小鼠B7-1和B7-2基因转染EL4细胞瘤苗抗肿瘤免疫作用的比较研究

目的:比较小鼠免疫共刺激信号B7-1和B7-2转化小鼠淋巴瘤细胞株EL4后,转化细胞介导的抗肿瘤免疫作用。方法:构建逆转录病毒表达载体pLXSN-mB7-1和pLXSN-mB7-2,转染野生型EL4细胞,获得高表达B7-1和B7-2分子的EL4/mB7-1和EL4/mB7-2细胞,并制备成瘤苗;分别应用LDH释放法、MTT法以及ELISA法检测比较两种瘤苗激活的T细胞的杀伤活性、细胞增殖和IL-2的分泌情况。结果:①EL4/mB7-1和EL4/mB7-2瘤苗刺激小鼠脾脏T淋巴细胞分泌IL-2的量明显超过野生型EL-4细胞(P<0.01);②24 h,EL4/mB7-1瘤苗刺激小鼠脾脏T淋巴细胞分泌的IL-2的量超过EL4/mB7-2瘤苗(P<0.05);48 h,EL4/mB7-2瘤苗刺激小鼠脾脏T淋巴细胞分泌IL-2的量超过EL4/mB7-1瘤苗(P<0.05);③EL4/mB7-1瘤苗和EL4/mB7-2瘤苗刺激小鼠T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的活性明显增强。EL4/mB7-2瘤苗刺激小鼠T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的活性与EL4/mB7-1瘤苗相当(P>0.05)。结论:mB7-1和mB7-2分子可活化T细胞分泌IL-2,两者刺激T细胞产生IL-2的高峰时间不同。mB7-2刺激T细胞产生CTL的杀伤活性与mB7-1无明显差别。

B7-2基因工程抗体的制备及体内外抗B淋巴瘤作用研究

构建B7-2人-鼠嵌合抗体基因表达质粒pIRES/ch3C8,经脂质体法转染真核表达细胞株CHO制备B7-2人-鼠嵌合抗体(命名为ch3C8)。该抗体能够识别人恶性B淋巴瘤细胞株Raji表面的B7-2分子并诱导其凋亡。ch3C8结构中来源于人Ig的Fc段可介导高效的ADCC及CDC效应。经ch3C8结合的Raji细胞接种于BALB/c裸鼠后的致瘤性消失。该抗体在B7-2相关肿瘤的生物治疗中具有潜在的应用价值。

鼠抗人B7-2单克隆抗体的研制及生物学特性研究

以天然高表达膜型B7-2分子的人恶性B淋巴瘤经胞株Daudi和B7-2基因转染细胞株L929-B7-2为免疫原及检测细胞株,采用B细胞杂交瘤技术建立了1株稳定分泌抗人B7-2单抗的杂交瘤,命名为6A5。快速定性试纸法鉴定6A5属小鼠IgG1亚类。经体内诱生腹水法制备单抗,小鼠腹水形成的阳性率为80%,腹水的收获量平均为5.9 ml/只小鼠。经免疫亲和层析法纯化,腹水中抗体蛋白的得率为1.1 mg/ml。采用间接免疫荧光法及流式细胞仪分析,单抗6A5与L929-B7-2、PBTC、Raji和Daudi的阳性结合率分别为99.9%、4.6%、90.6%和99.1%。将6A5(终浓度为5μg/ml)加入到Daudi细胞的培养体系中,经显微镜观察及MTT法分析,6A5对Daudi细胞的生长在24 h内具有抑制作用(P<0.05)。以丝裂霉素处理的L929-B7-2为刺激细胞,PBTC为反应细胞,加入6A5共同培养。经MTT法分析,6A5能阻断B7-2介导的协同刺激信号,抑制PBTC增殖(P<0.05)。提示6A5是一株功能性抗体,在B7-2分子相关的基础和应用研究中具有重要的价值。

分子佐剂C3d上调Raji细胞协同刺激分子B7-1和B7-2的表达(简报)

我们在以往研究中，引入选择性增强体液免疫效应的新型分子佐剂C3d，成功构建了重组避孕疫苗hCGβ-C3d3，通过免疫Th2型优势的BALB／c小鼠和Th1型优势的C57BL／6小鼠．显示分子佐剂C3d在不同品系小鼠均使免疫效应从Th1型细胞免疫向Th2型体液免疫偏倚。

人B7-2和增强型绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建

目的 构建含人B7- 2与增强型绿色荧光蛋白融合基因表达载体p EGFP- N3- B7- 2。方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)方法从重症肌无力患者胸腺组织中扩增到人B7- 2 c DNA基因片段,经回收、纯化、酶切后,依次连接到质粒p GEM- Teasy和p EGFP- N3上。结果 通过酶切和序列分析证实插入片段序列正确。结论 应用基因工程技术构建成功p EGFP- N3- B7- 2融合基因表达载体,为增强型绿色荧光蛋白作为人B7- 2生物标记分子,转染肿瘤细胞及树突状细胞制备疫苗奠定了基础。

川芎嗪对活动期狼疮性肾炎外周血单个核细胞B7-1和B7-2mRNA表达的影响

目的 :探讨川芎嗪对活动期狼疮肾炎 (LN)外周血单个核细胞 (PBMC)的B7- 1(CD80 )和B7- 2 (CD86 )mRNA表达的影响 ,为临床使用川芎嗪治疗LN提供理论依据。方法 :取活动期LN患者PBMC培养 ,分别以川芎嗪、地塞米松和川芎嗪 +地塞米松进行处理 ,以PBS对照 ,采用半定量反转录PCR的方法 ,检测PBMC的B7- 1和B7- 2mR NA表达。结果 :与对照组相比 ,川芎嗪组和地塞米松组均能明显抑制B7- 2mRNA表达 (P <0 .0 5 ) ,而川芎嗪 +地塞米松组对B7- 2mRNA表达的抑制更加明显 (P <0 .0 1)。各组对B7- 1mRNA表达均无显著影响 (P >0 .0 5 )。结论 :川芎嗪能下调活动期LN外周血单个核细胞B7- 2mRNA表达 ,合并使用地塞米松能更好地抑制B7- 2mRNA表达。

小鼠B7-2基因的克隆、测序及其重组质粒的构建

目的 :克隆小鼠 B7- 2基因编码区的 c DNA序列 ,并构建其表达载体。方法 :利用逆转录聚合酶链反应 (RT- PCR)法 ,以小鼠脾细胞 m RNA为模板 ,扩增获得 B7- 2基因 ,与 p MD- 1 8T连接做全自动测序 ,并利用基因重组技术构建包含 B7- 2基因的表达质粒 pc DNA3.1 - CMV- B7- 2及 pc DNA3.1 - Egr- B7- 2。结果 :经测序证实获得的 B7- 2基因与文献报道的基本一致 ,并成功地构建了表达质粒。结论 :成功克隆了 B7- 2的编码基因 ,并成功构建了表达载体 pc DNA3.1 - CMV- B7- 2及 pc DNA3.1 - Egr- B7-

同时表达4-1BBL B7.1及B7.2三个共刺激分子基因小鼠肝癌细胞系的建立和意义

目的:建立同时表达4-1BBL、B7.1及B7.2三个共刺激分子基因小鼠原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)细胞系。方法:将B7.1和B7.2全长cDNA的质粒酶切,构建pcDNA3.1-B7.1-IRES-B7.2重组子,酶切法鉴定。用阳离子脂质体(LipofectamineReagent)将重组子转染H22,经均霉素(Hygromycin,300!g/ml)筛选,阳性克隆命名为H22-CD80/CD86+细胞。逆转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)检测目的基因在H22-CD80/CD86+变异株的表达。采用同样方法将pCI-neo-4-1BBL质粒转入H22-CD80/CD86+细胞,G418筛选,阳性克隆命名为H22-CD80/CD86/CD137L+细胞。流式细胞仪检测三种基因在细胞克隆中的表达。结果:pcDNA3.1-B7.1-IRES-B7.2重组子经酶切鉴定,同时获得B7.1(862bp)和B7.2(984bp)目的基因片段和5.6kbp线性化pcDNA3.1载体片段;重组子测序结果与Genebank中B7.1和B7.2序列相符,证实构建成功。RT-PCR及FCM检测结果显示B7.1、B7.2及4-1BBL基因分别在H22-CD80/CD86+细胞及H22-CD80/CD86/CD137L+细胞中获得稳定、高效联合表达。结论:pcDNA3.1-B7.1-IRES-B7.2重组子构建正确,H22-CD80/CD86/CD137L+变异株可同时稳定表达B7.1、B7.2和4-1BBL三个共刺激分子基因。

B7-1与B7-2对调节人IL-2基因的转录因子NF-κB和AP-1的相同作用

为了解B7共刺激对细胞因子 ,特别是对IL 2mRNA及转录因子NF κB和AP 1的影响 ,探讨B7介导的IL 2调节的分子机制 ,在异基因混合淋巴细胞反应 (MLR)体系中分别或联合加入抗B7 1、抗B7 2单克隆抗体和CTLA 4Ig以阻断B7/CD2 8信号传导 ,通过竞争性PCR定量检测其对IL 2和IL 4mRNA的影响 ,并初步测定IFN γmRNA的改变 ,同时用转染MHCⅡ类分子及联合转染等量B7 1或B7 2的NIH3T3转基因细胞tDR7,tDR7/B7 1和tDR7/B7 2刺激CD2 8+ T细胞 ,通过DNA 蛋白结合实验观察B7对IL 2转录因子NF κB和AP 1的影响。结果表明 :抗B7 2单抗和CTLA 4Ig可明显抑制B7介导的IL 2和IL 4mRNA合成 ,而抗B7 1单抗仅有轻度抑制作用 ,2种或 3种抗体联合应用时抑制作用相加。MLR 1 - 6小时 ,单独tDR7即可诱导NF κB的表达 ,联合转染B7早期对其结合活力无明显影响 ,6小时后tDR7诱导作用减弱 ,B7却可显著延长tDR7的诱导作用至 72小时。tDR7早期同样可诱导AP 1的表达 ,联合转染B7分子在 2 4小时内对其有一定的抑制作用 ,而在反应后期可延长tDR7对AP 1的上调作用 ,B7 1与B7 2间作用未见明显不同。结论 :B7通过减少IL 2mRNA降解和影响基因转录而上调IL 2分泌 ,并可同时影响多种细胞因子分泌 ;在转录水平B7 1与B7 2作用未见明显不同 。

共刺激分子B7-2对小鼠肝癌治疗作用的实验研究

目的 :应用转染有小鼠B7- 2基因片段的肝癌细胞 ,建立小鼠肝癌模型 ,观察小鼠肿瘤生长和消退情况 ,研究共刺激分子B7- 2对肿瘤的免疫治疗作用。方法 :建立BALB/c小鼠转B7- 2基因肝癌细胞株H2 2 /B7- 2 ,细胞计数法测定肿瘤细胞体外增殖能力 ;BALB/c鼠皮下接种H2 2 /B7- 2及野生型H2 2细胞H2 2 /Wt,以空载体转染细胞H2 2 /neo为对照 ,建立小鼠肝癌模型 ,观察小鼠成瘤期、荷瘤小鼠存活期及肿瘤结节大小 ;同源淋巴细胞肿瘤细胞混合培养 (MTLCs)后测定淋巴细胞增殖指数和CTLs活性 ,同时测定培养上清IL -2、IFNγ ,研究B7- 2分子的抗肿瘤免疫效果。结果 :细胞在体外增殖能力一致 (P =0 .782 ) ;当接种不同肿瘤细胞后 ,三组动物都发生肿瘤 ,接种H2 2 /B7- 2组肿瘤形成有迟发性 ,并在接种 18d后肿瘤都开始缩小 ,但最终不会完全消失 ;接种H2 2 /Wt和H2 2 /neo组动物肿瘤呈进行性生长。H2 2 /B7- 2在体外刺激淋巴细胞增殖和诱导CTLs的能力明显强于对照细胞 (P <0 .0 5 )。结论 :共刺激分子B7- 2能增强肝癌细胞的免疫原性 ,它在抗肿瘤早期发挥作用。用其治疗肝癌是有效的 ,但不能介导完全和长期的抗肿瘤效应。

人B7-2基因修饰的食管癌细胞瘤苗抗肿瘤的免疫效应

目的:研究人B7-2基因修饰的食管癌细胞作为瘤苗的抗肿瘤作用。方法:将真核荧光表达载体pEGFP-C3-B7-2,通过脂质体转染技术转染人食管癌细胞株EC9706。外周血来源的树突状细胞(DC)负载肿瘤抗原后,与自体T淋巴细胞共培养3d,获得细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测CTL对转染和未转染pEGFP-C3-B7-2的人食管癌细胞EC9706的杀伤活性。结果:CTL对转染pEGFP-C3-B7-2的肿瘤细胞的杀伤活性大于转染pEGFP-C3和未转染细胞的杀伤活性(P<0.05)。结论:人B7-2基因修饰的EC9706肿瘤细胞瘤苗,可诱导出明显的抗EC9706细胞的免疫效应。

编码人B7-2胞外区cDNA的克隆、表达及生物活性鉴定

B7 2分子是共刺激信号系统B7/CD2 8/CTLA 4中的重要成员之一 ,为了更深入地探讨B7 2分子在调控T细胞增殖、分化及相关信号传导过程中的作用 ,本研究通过聚合酶链式反应 (PCR)扩增编码人B7 2分子胞外区的cDNA ,测序后定向插入多个原核表达载体并诱导目的蛋白表达 ,用Western印迹和MTT鉴定生物活性。结果表明 :通过pGEX 4T 2载体实现了在宿主菌BL 2 1 (DE3) codenplus RIL中较高水平的表达 ,蛋白表达量为 2 0 %。经Western印迹和MTT鉴定 ,所表达及初步纯化的B7 2胞外区重组蛋白能与抗人B7 2单抗发生特异性结合 ;在抗人CD3单抗的协同下 ,B7 2胞外区重组蛋白能有效地促进外周血单核细胞的增殖。结论 :B7 2胞外区重组蛋白的获得为进一步研究B7

过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞共刺激分子B7-1、B7-2与CD28的表达及意义

目的探讨免疫共刺激分子B7-1、B7-2和CD28在过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞(PBMC)中的表达及其意义。方法应用流式细胞仪(FCM)从蛋白质水平检测了38例过敏性紫癜(HSP)患儿(其中11例诊断为紫癜性肾炎)和20例正常儿童PBMC中B7-1、B7-2和CD28的表达,并分析其与24 h尿微量白蛋白的关系。结果过敏性紫癜患儿B7-2蛋白和CD28蛋白的表达水平(相对平均荧光强度,RMFI)均高于正常对照组(P<0.05),各组间B7-1蛋白表达水平的差别无显著性意义(P>0.05)。18例24 h尿微量白蛋白(24h UMA)增高的HSP患儿共刺激分子B7-2、CD28蛋白的表达与24 h UMA呈等级正相关。结论过敏性紫癜患儿PBMC共刺激分子B7-2、CD28表达异常增加,可能参与HSP的起病,而且B7-2、CD28蛋白的表达与24 h尿微量白蛋白呈等级正相关,提示可以作为监测HSP患儿病情以及检测早期肾脏损害的免疫学指标。

鼠抗人B7-2分子单链抗体基因的构建及其在家蚕中的表达

B7-2蛋白为免疫球蛋白超家族(IGSF)成员之一。采用PCR法从分泌鼠抗人B7-2抗体的杂交瘤细胞株克隆出该单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法,在VH和VL可变区基因间引入连接肽(Gly4Ser)3编码序列,体外构建抗人B7-2的鼠源单链抗体基因B7-2-ScFv。利用新型杂交病毒HyNPV的Bac-to-Bac表达系统,将B7-2-ScFv基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTa中,获得重组转移载体pFastBacHTa-B7-2-ScFv,转化大肠杆菌DH10Bac,获得重组杆粒Bacmid-B7-2-ScFv。将此重组杆粒的DNA转染Sf9细胞,获得重组病毒HyNPV-ScFv。感染该重组病毒的BmN细胞经SDS-PAGE和Western blotting分析表明,至感染24h时目的蛋白已有表达,96h达到最高表达水平,表达产物的分子质量约31kD。用该重组病毒感染家蚕5龄起蚕,感染后96h蚕体表现出明显的发病症状。RT-PCR结果表明,5龄起蚕感染后48h,在脂肪体内已有目的基因转录,一直持续到感染后120h;SDS-PAGE和Western blotting分析表明,5龄起蚕感染96h后方可在脂肪体中检测到目的蛋白表达。构建并在家蚕中成功表达鼠抗人B7-2单链抗体,为深入研究和开发该抗体奠定了基础。

B7-2分子在肝硬化患者肝脏组织中表达的Western blot检测方法研究

目的:建立肝硬化患者肝组织B7-2分子W estern b lot检测方法。方法:设置不同的一抗稀释比,筛选合适一抗稀释比。设置阳性对照、阴性对照,确认目的蛋白。结果:在一抗稀释比从1∶50到1∶200的范围内,蛋白显影灰度逐渐增加,随着一抗稀释比从1∶200到1∶1 000的进一步递减,蛋白显影灰度却逐渐减弱。结论:在一抗稀释比为1∶200条件下,B7-2分子在肝硬化患者肝脏组织中呈强阳性表达。

X射线对小鼠腹腔巨噬细胞表达B7-1和B7-2的影响

目的 :观察 X射线全身照射对小鼠腹腔巨噬细胞表达 B7- 1和 B7- 2的影响。方法 :采用免疫组织化学法 ( ABC法 )。结果 :小鼠腹腔巨噬细胞表达 B7- 2达到高峰的时间早于 B7- 1,而且 B7- 2表达幅度也高于 B7- 1。剂量 -效应关系的研究表明 ,B7- 1和 B7- 2的表达均在 0 .0 75Gy剂量点出现峰值 ,而在较大剂量照射时也出现一个峰值。但在不同分度分析结果中发现 ,低剂量 X射线照射组的高密度细胞百分数比较大剂量组多。结论 :B7分子的表达上调可能是参与低剂量电离辐射免疫增强效应的重要因素。

人B7-1和B7-2cDNA的克隆及鉴定

目的 :为探索性构建全新型重组人B7 PE40绿脓杆菌外毒素融合蛋白以长期诱导免疫耐受 ,本研究从急性B淋巴细胞白血病细胞株Raji中克隆N 末端分别缺失 34和 1 6个氨基酸的人B7 l和B7 2基因胞外区 ,并构建含此基因的重组质粒。方法 :根据B7 1和B7 2基因序列设计合成可扩增B7 1和B7 2cDNA的特异性引物 ,用RT PCR的方法从Raji细胞总RNA中扩增B7 1和B7 2cDNA ,并克隆至 pGEM T载体中 ,经酶切鉴定后再进行序列分析。结果和结论 :从Raji细胞中扩增出预期的 6 2 4和 6 75bp的B7 1和B7 2cDNA ,将其克隆至 pGEM T载体中 ,分别经EcoRI/HindⅢ和BamHI/Sphl双酶切电泳和序列分析确证 ,为进一步构建人B7