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小鼠对HBV DNA疫苗的免疫应答及细胞因子的免疫佐剂效应 被引量:8
1
作者 杜德伟 周永兴 +3 位作者 白宪光 冯志华 李光玉 姚志强 《医学研究生学报》 CAS 2001年第2期95-99,共5页
目的 :观察编码小鼠 IL- 2及 IL- 12的真核表达载体 ,对 HBV DNA疫苗诱导 Balb/ c小鼠 (H- 2 d )免疫应答的调节作用及其对稳定表达 HBs Ag的小鼠肥大细胞瘤 P815细胞 (P 815 - HBV- S)成瘤性的影响。 方法 :肌内注射HBV DNA疫苗及细... 目的 :观察编码小鼠 IL- 2及 IL- 12的真核表达载体 ,对 HBV DNA疫苗诱导 Balb/ c小鼠 (H- 2 d )免疫应答的调节作用及其对稳定表达 HBs Ag的小鼠肥大细胞瘤 P815细胞 (P 815 - HBV- S)成瘤性的影响。 方法 :肌内注射HBV DNA疫苗及细胞因子真核表达载体 ;背部皮下接种 P 815 - HBV - S细胞 ,观察成瘤情况 ;EL ISA法测定血清抗HBs;4h5 1 Cr释放法检测小鼠脾细胞 CTL 活性。 结果 :免疫 8周后 ,以 p CR3.1- S、p CR3.1- S+IL- 2及 p CR3.1-S+IL- 12免疫的小鼠血清 ,45 0 nm A值分别为 0 .87± 0 .1、1.98± 0 .17及 1.6 7± 0 .15 ,均较 p CR3.1组显著提高(P<0 .0 5 )。CTL 细胞杀伤活性分别为 (5 0 .5± 6 .4) %、(6 1.9± 7.1) %及 (73.3± 8.8) % ,后两组与 p CR3.1- S组比较差异均显著 (P<0 .0 5 )。脾细胞悬液经抗 CD4+ 单克隆抗体处理后 ,CTL细胞杀伤活性分别为 (48.3± 5 .9) %、(5 6 .2± 7.5 ) %和 (75 .6± 9.1) % ,抗 CD8+ 单克隆抗体处理后分别为 (10 .6± 1.4) %、(13.6± 1.9) %和 (16 .9±2 .3) %。对照组成瘤率为 10 0 % ,p CR3.1- S组小鼠成瘤率为 12 .5 % ,p CR3.1- S+IL- 12真核表达载体组成瘤率为0 ,对照组平均存活期和 6周后存活率分别为 2 8.4天和 0天。后两组分别 >38.2天及 45? 展开更多
关键词 DNA疫苗 乙型肝炎表面抗原 细胞因子 小鼠 真核表达载体
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携带人β干扰素基因的人乙型肝炎特异性真核表达载体的构建 被引量:9
2
作者 潘欣 柯重伟 +5 位作者 潘卫 武文斌 张斌 贺祥 曹广文 戚中田 《世界华人消化杂志》 CAS 2000年第5期520-523,共4页
目的构建乙型肝炎病毒(HBV)C 区启动子调控的人β干扰素(IFN-β)基因的真核表达载体.方法切除真核表达载体 pcDNA3.1(+)-DT_(390)-VEG_(exon7)内部的 CMV 启动子及 DT_(390)序列使之成为 p3.1V_7;从逆转录病毒载体 pMNSM-IFN-β质粒中... 目的构建乙型肝炎病毒(HBV)C 区启动子调控的人β干扰素(IFN-β)基因的真核表达载体.方法切除真核表达载体 pcDNA3.1(+)-DT_(390)-VEG_(exon7)内部的 CMV 启动子及 DT_(390)序列使之成为 p3.1V_7;从逆转录病毒载体 pMNSM-IFN-β质粒中游离人β干扰素基因;用 PCR 方法从 pGEM.7Z-HBV 质粒中扩增人乙型肝炎病毒(HBV)的 C区启动子序列;通过转换酶切位点,将 HBV C 区启动子和人β干扰素基因共同插入到 p3.1V_7中,构建成受 HBV C 区启动子控制的人β干扰素基因真核表达载体 p3.1 V_7-HBV.CP-IFN-β.结果构建完成携带人β干扰素基因的人乙型肝炎特异性真核表达载体.结论该载体为慢性病毒性肝炎的特异性干扰素基因治疗奠定了基础. 展开更多
关键词 IFN-β基因 乙型肝炎病毒 真核表达载体 治疗
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肝细胞癌组织中HBx基因缺失型突变体真核表达载体的构建和鉴定 被引量:6
3
作者 朱平安 谭德明 +2 位作者 陈莉 彭忠田 宋琳 《热带医学杂志》 CAS 2008年第4期332-334,361,共4页
目的构建缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431真核表达载体。方法以pGM-T/HBx-d382和pGM-T/HBx-d431质粒为模板,PCR扩增含KpnⅠ和ApaⅠ酶切位点的HBx基因片段。双酶切后再与载体pcDNA3载体重组连接。重组质粒转化到大肠杆菌DH5α后,经酶切... 目的构建缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431真核表达载体。方法以pGM-T/HBx-d382和pGM-T/HBx-d431质粒为模板,PCR扩增含KpnⅠ和ApaⅠ酶切位点的HBx基因片段。双酶切后再与载体pcDNA3载体重组连接。重组质粒转化到大肠杆菌DH5α后,经酶切鉴定和DNA序列测定,筛选出重组pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431真核表达载体。结果成功构建了重组pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431真核表达载体,经DNA序列测定与比对,重组前后HBx基因片段序列一致。结论pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431真核表达载体构建成功,可为HBx基因缺失型突变体,特别是HBx-d382基因的生物学功能研究提供基因材料。 展开更多
关键词 HBX基因 肝细胞癌 乙型肝炎病毒 缺失型突变体 真核表达载体
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人巨细胞病毒gB基因真核表达载体在小鼠中的免疫效果 被引量:3
4
作者 张中洋 李秀玲 何薇薇 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2005年第6期487-489,共3页
目的观察人巨细胞病毒(HCMV)gB基因真核表达载体在小鼠中的免疫效果.方法大量提取目的质粒,分3个剂量组进行多点肌肉注射免疫小鼠,利用MTT法检测免疫小鼠的T细胞增殖活性,ELISA法检测小鼠血清中HCMV特异性抗体,中和试验检测小鼠血清中... 目的观察人巨细胞病毒(HCMV)gB基因真核表达载体在小鼠中的免疫效果.方法大量提取目的质粒,分3个剂量组进行多点肌肉注射免疫小鼠,利用MTT法检测免疫小鼠的T细胞增殖活性,ELISA法检测小鼠血清中HCMV特异性抗体,中和试验检测小鼠血清中和抗体.结果 ELISA检测结果表明,与空白对照、空载体对照组相比,3个剂量组pcDNA3.1/gB质粒免疫后小鼠血浆中抗HCMV IgG抗体水平均明显增高(P<0.05),中和抗体水平为1:20~1:40,而对照组血清中无中和抗体存在.淋巴细胞增殖指数免疫小鼠与正常小鼠差异无显著意义.结论已构建的HCMVgB基因真核表达载体可以诱导小鼠产生明显的体液免疫,为核酸疫苗研究奠定了基础. 展开更多
关键词 人巨细胞病毒 GB基因 真核表达载体 小鼠 动物实验 免疫反应 核酸疫苗
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HBV全基因C区突变株在永生化B淋巴母细胞系中的稳定表达 被引量:2
5
作者 张明霞 周福元 +3 位作者 刁志宏 何海棠 侯金林 骆抗先 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期725-729,共5页
目的构建携带V60、G87和L97突变位点的HBV全基因组真核表达载体,转染慢性HBV感染者永生化B淋巴母细胞系(LCLs)。方法用定点突变技术将HBVp3.8Ⅱ质粒C基因区3个氨基酸V60、G87、L97进行突变(p3.8Ⅱ-V60,G87,L97),转化E.coli.XL1-Blue感... 目的构建携带V60、G87和L97突变位点的HBV全基因组真核表达载体,转染慢性HBV感染者永生化B淋巴母细胞系(LCLs)。方法用定点突变技术将HBVp3.8Ⅱ质粒C基因区3个氨基酸V60、G87、L97进行突变(p3.8Ⅱ-V60,G87,L97),转化E.coli.XL1-Blue感受态细胞扩增筛选,用限制性内切酶SacⅠ和KpnⅠ分别将野生型和突变型p3.8Ⅱ质粒进行双酶切,插入EBV-plpp真核细胞表达载体,转染LCLs,潮霉素稳定筛选后,鉴定目的基因在转染细胞能够稳定表达。结果与结论DNA序列分析表明,野型HBVDNA核心区第60、87、97位氨基酸发生了预期的突变,WesternBlotting和微粒子免疫荧光法证明转染的LCLs能稳定表达HBV抗原,证实成功构建了预期细胞模型。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 变异 真核细胞表达载体 永生化B淋巴母细胞
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牛乳铁蛋白肽基因LfcinB的合成及真核表达载体的构建 被引量:3
6
作者 孙东波 林云成 +4 位作者 郭东华 王建发 张敏 林玉才 武瑞 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2009年第5期95-98,共4页
根据APD抗菌肽数据库报道的牛乳铁蛋白肽LfcinB氨基酸序列,合成编码LfcinB基因的2条互补的寡核苷酸链,退火后在5′端和3′端分别形成含有BamHI和XhoI位点粘性末端的双链DNA。真核表达载体pcDNA3.1(+)经BamHI和XhoI限制性内切酶双酶切处... 根据APD抗菌肽数据库报道的牛乳铁蛋白肽LfcinB氨基酸序列,合成编码LfcinB基因的2条互补的寡核苷酸链,退火后在5′端和3′端分别形成含有BamHI和XhoI位点粘性末端的双链DNA。真核表达载体pcDNA3.1(+)经BamHI和XhoI限制性内切酶双酶切处理后与合成的LfcinB基因进行连接,连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞,提取质粒DNA进行测序。测序结果显示,牛乳铁蛋白肽LfcinB基因成功克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,为进一步表达和抗菌活性研究奠定物质基础。 展开更多
关键词 牛乳铁蛋白 牛乳铁蛋白肽 真核表达载体
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猪APOBEC3F基因克隆及真核表达载体的构建与鉴定 被引量:4
7
作者 孙宇 罗佳 +1 位作者 马玉媛 章金刚 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第18期1904-1906,共3页
目的克隆猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3F(apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalyticpolypeptide 3F,APOBEC3F)基因,构建真核表达载体实现其在体外表达与鉴定。方法分离4头21周龄,体质量25~30kg的雌性健康五指山猪的外... 目的克隆猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3F(apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalyticpolypeptide 3F,APOBEC3F)基因,构建真核表达载体实现其在体外表达与鉴定。方法分离4头21周龄,体质量25~30kg的雌性健康五指山猪的外周血单个核细胞,Trizol法提取细胞总RNA,RT-PCR特异性扩增目的基因,目的基因插入真核表达载体pDsRed1-N1及改造的pCDNA3-Flage载体构建表达质粒并在PK-15细胞中进行表达。激光共聚焦显微镜及Western blot鉴定目的基因的表达。结果克隆的目的基因与公布的基因序列同源性达99%;激光共聚焦显微镜显示目的基因在PK-15细胞表达,且表达产物定位于细胞质内;Western blot检测示表达的目的蛋白大小与预期相符。结论成功构建了猪APOBEC3F真核表达载体。 展开更多
关键词 APOBEC3F 克隆 真核表达载体 鉴定
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HBeAg真核表达载体的构建及其在Bewo细胞中的表达 被引量:2
8
作者 资捷 王前 +2 位作者 郑磊 熊石龙 蔡贞 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期54-56,68,共4页
目的构建乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBe,并观察其在Bewo细胞中的表达。方法用PCR方法从质粒pMD18T-HBV中扩增HBeAg基因,克隆到pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBe,通过酶切、PCR及测序鉴定,并将该... 目的构建乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBe,并观察其在Bewo细胞中的表达。方法用PCR方法从质粒pMD18T-HBV中扩增HBeAg基因,克隆到pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBe,通过酶切、PCR及测序鉴定,并将该载体转染Bewo细胞,72h后,用Western免疫印迹和微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测HBeAg蛋白在胞内和上清中的表达。结果通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建HBeAg表达载体,该载体可以在Bewo细胞系中表达HBeAg,并可分泌HBeAg。结论构建了HBeAg真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBe,为研究胞内HBeAg对Bewo细胞Toll样受体表达的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 乙型肝炎病毒E抗原 真核表达载体 BEWO细胞
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稳定转染HBx基因的HepG2细胞株的建立及其对p53-p21途径的影响 被引量:2
9
作者 曹鹏飞 柳永和 贺玉香 《肿瘤防治研究》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期380-383,共4页
目的将构建的乙型肝炎病毒X基因的真核表达载体稳定转染HepG2细胞株,并研究转染后对p53-p21途径的影响。方法用基因转染的方法将已构建的载体pcDNA3.1-HBx转染入肝癌细胞HepG2中,G418筛选出稳定转染X基因的细胞株。细胞生长曲线、平板... 目的将构建的乙型肝炎病毒X基因的真核表达载体稳定转染HepG2细胞株,并研究转染后对p53-p21途径的影响。方法用基因转染的方法将已构建的载体pcDNA3.1-HBx转染入肝癌细胞HepG2中,G418筛选出稳定转染X基因的细胞株。细胞生长曲线、平板克隆形成实验检测转染后肝癌细胞的恶性表型,流式细胞仪检测细胞凋亡和周期,Western blot检测p53蛋白的表达,RT-PCR检测p21基因。结果成功筛选出pcDNA3.1-HBx稳定转染的HepG2细胞株;细胞生长实验、平板克隆形成实验显示稳定转染乙型肝炎病毒X基因的肝癌细胞恶性表型增高;流式细胞仪结果显示,转染后的细胞株凋亡率增高,G1/G0期细胞减少,G2期细胞增多;Western blot和RT-PCR分别显示,转染株p53蛋白表达增高,且下调p21基因水平。结论乙型肝炎病毒X蛋白可刺激肝癌细胞生长,稳定转染X基因的细胞株可能通过p53-p21途径增加肝癌细胞的恶性表型。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒X基因 真核表达载体 HEPG2细胞 p53-p21途径
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猪Sar1b基因真核表达载体构建及鉴定 被引量:1
10
作者 王学敏 李碧侠 任守文 《安徽农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期573-576,共4页
根据已发表的猪Sar1b基因序列设计合成1对带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,用RT-PCR方法从猪肝脏组织总RNA中扩增出Sar1b基因cDNA序列,纯化后,经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),获得pcDNA3.1(+)-Sar1b重组载体。通... 根据已发表的猪Sar1b基因序列设计合成1对带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,用RT-PCR方法从猪肝脏组织总RNA中扩增出Sar1b基因cDNA序列,纯化后,经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),获得pcDNA3.1(+)-Sar1b重组载体。通过菌液PCR、双酶切及DNA直接测序分析,证实重组表达载体pcDNA3.1(+)-Sar1b构建成功。 展开更多
关键词 Sarlb基因 真核表达载体 PCDNA3 1(+)
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猪APOBEC3F基因真核表达载体的构建及其在MARC145细胞中的表达定位 被引量:2
11
作者 孟春花 王春玲 +3 位作者 李静心 李隐侠 朱前明 曹少先 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第6期1344-1349,共6页
载脂蛋白B m RNA编辑酶催化多肽3F(APOBEC3F)属固有免疫系统中的重要成员,对人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)等多种病毒的复制具有广泛的抑制作用。为构建APOBEC3F基因的真核表达载体,并检测其在体外培养的MARC145细胞中的表达... 载脂蛋白B m RNA编辑酶催化多肽3F(APOBEC3F)属固有免疫系统中的重要成员,对人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)等多种病毒的复制具有广泛的抑制作用。为构建APOBEC3F基因的真核表达载体,并检测其在体外培养的MARC145细胞中的表达情况,通过RT-PCR从猪脾脏组织扩增APOBEC3F基因,定向克隆到表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体p EGFP-CMV中,构建p EGFP-APOBEC3F。PCR扩增及测序显示,APOBEC3F插入载体位置、方向及序列均正确。p EGFP-APOBEC3F经脂质体介导法转染MARC145细胞,转染后24 h APOBEC3F m RNA的水平升至最高。细胞免疫化学法检测发现APOBEC3F蛋白主要在MARC145细胞质中表达。研究结果为体外研究猪APOBEC3F基因在抗猪蓝耳病中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 APOBEC3F 真核表达载体 MARC145细胞 转染 荧光定量PCR 脂质体
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miR-148a/b真核表达质粒的构建及其在胰腺癌细胞系中的表达 被引量:1
12
作者 肖卫东 刘智文 +3 位作者 文武 王福飞 廖国良 李勇 《南昌大学学报(医学版)》 CAS 2014年第1期7-9,F0003,共4页
目的构建miR-148a/b真核表达质粒,转染胰腺癌AsPC-1细胞,并观察其miR-148a/b的表达水平。方法根据miRBase提供的序列合成miR-148a/b前体,PCR扩增后形成双链,插入线性化真核表达质粒pcDNA3.1,构建pcDNA3.1/miR-148a/b,进行酶切和测序鉴... 目的构建miR-148a/b真核表达质粒,转染胰腺癌AsPC-1细胞,并观察其miR-148a/b的表达水平。方法根据miRBase提供的序列合成miR-148a/b前体,PCR扩增后形成双链,插入线性化真核表达质粒pcDNA3.1,构建pcDNA3.1/miR-148a/b,进行酶切和测序鉴定。将胰腺癌AsPC-1细胞分4组进行质粒转染:转染pcDNA3.1/miR-148a(miR-148a组)、转染pcDNA3.1/miR-148b(miR-148b组)、转染pcDNA3.1(空质粒对照组)和仅加脂质体(空白对照组)。转染48 h后,采用定量PCR法检测各组细胞中miR-148a/b的表达量。结果 pcDNA3.1/miR-148a/b的酶切和测序与miRBase提供的序列完全一致。转染48 h后,miR-148a组AsPC-1细胞中的miR-148a表达量明显高于空质粒对照组和空白对照组(6.76±0.35比1.00±0.54、1.02±0.40,均P<0.05),miR-148b组AsPC-1细胞中的miR-148b表达量明显高于空质粒对照组和空白对照组(3.28±0.08比1.02±0.35、1.01±0.28,均P<0.05)。结论成功构建了miR-148a/b真核表达质粒pcDNA3.1/miR-148a/b,该质粒能显著上调胰腺癌AsPC-1细胞的miR-148a/b表达水平。 展开更多
关键词 miR-148a b 真核表达质粒 胰腺癌
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H-2K^b cDNA的克隆及其在多种真核细胞中的表达 被引量:2
13
作者 钱书兵 钱关祥 陈诗书 《上海第二医科大学学报》 CSCD 1999年第3期193-196,200,共5页
目的克隆H-2KbcDNA及研究其在多种真核细胞中的表达。方法RT-PCR法扩增H-2KbcDNA,克隆入双顺反子逆转录病毒载体pGCEN,PA317包装出重组病毒后,分别感染NIH3T3、COS7及MM45T.Li,PCR和RT-PCR分析目的基因表达,FACS分析H-2Kb在... 目的克隆H-2KbcDNA及研究其在多种真核细胞中的表达。方法RT-PCR法扩增H-2KbcDNA,克隆入双顺反子逆转录病毒载体pGCEN,PA317包装出重组病毒后,分别感染NIH3T3、COS7及MM45T.Li,PCR和RT-PCR分析目的基因表达,FACS分析H-2Kb在细胞膜上的表达。结果以双顺反子逆转录病毒载体pGCEN介导,分别建立了H-2Kb基因转导细胞:NIH3T3/Kb、COS7/Kb及MM45T.Li/Kb。PCR结果表明目的基因已存在于宿主细胞中,RT-PCR结果表明目的基因已获得正确表达。FACS结果表明H-2Kb分子已稳定表达在细胞膜表面。结论MHC分子基因在多种真核细胞中的表达为研究抗原递呈及抗肿瘤作用提供了基础。 展开更多
关键词 H-2K^b基因 克隆 逆转录病毒载体 真核表达 CDNA
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定点诱变HBcAg质粒在人永生化B淋巴母细胞系中的稳定表达 被引量:1
14
作者 张明霞 刁志宏 +1 位作者 侯金林 骆抗先 《第四军医大学学报》 北大核心 2006年第24期2229-2232,共4页
目的:构建携带V60,G87,L97突变位点的HBV全基因组真核细胞表达载体,转染慢性HBV感染者永生化B淋巴母细胞系(LCL),建立相同HLA背景下的慢性HBV感染CTL应答的刺激细胞和靶细胞.方法:用定点突变技术在HBVp3.8Ⅱ质粒C基因区3个氨基酸V60,G87... 目的:构建携带V60,G87,L97突变位点的HBV全基因组真核细胞表达载体,转染慢性HBV感染者永生化B淋巴母细胞系(LCL),建立相同HLA背景下的慢性HBV感染CTL应答的刺激细胞和靶细胞.方法:用定点突变技术在HBVp3.8Ⅱ质粒C基因区3个氨基酸V60,G87,L97位置进行突变(p3.8Ⅱ-V60,G87,L97),转化E.coliXL1-Blue感受态细胞扩增筛选,用限制性内切酶SacⅠ和KpnⅠ分别将野生型和突变型p3.8Ⅱ质粒进行双酶切,插入EBO-plpp真核细胞表达载体,转染LCL,潮霉素稳定筛选后,鉴定目的基因在转染细胞是能够稳定表达.结果:DNA序列分析表明,野型HBVDNA核心区第60,87,97位氨基酸发生了预期的突变,WesternBlot和微粒子免疫荧光法证明,转染的LCL能稳定表达HBV抗原.结论:定点诱变HBcAg质粒在人永生化B淋巴母细胞系中可稳定表达. 展开更多
关键词 肝炎病毒 乙型 肝炎 核心抗原 乙型 突变 真核细胞表达载体 B淋巴母细胞系
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HBV X基因真核细胞载体的构建 被引量:1
15
作者 杨昊 柳永和 +2 位作者 李闻文 成军 刘妍 《实用预防医学》 CAS 2004年第3期459-461,共3页
目的 为了探讨HBVX基因与慢性乙型肝炎及肝癌发生的关系 ,构建含X基因的真核表达质粒。 方法 用PCR方法扩增含EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的X基因序列 ,对PUC118载体及X基因PCR产物双酶切 ,用连接酶将两者连接并转化大肠杆菌JM 10 9,称PU... 目的 为了探讨HBVX基因与慢性乙型肝炎及肝癌发生的关系 ,构建含X基因的真核表达质粒。 方法 用PCR方法扩增含EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的X基因序列 ,对PUC118载体及X基因PCR产物双酶切 ,用连接酶将两者连接并转化大肠杆菌JM 10 9,称PUC118-HBx ,再将PUC118-HBx与PCDNA3 .1( +)双酶切 ,将两者连接并转化大肠杆菌DH5α ,称PCDNA3 .1( +) -HBx ,并对其进行序列测定。 结果 已构建PCDNA3 .1( +) -HBx载体 ,经序列测定含有完整的X基因片段。 结论 PCDNA3 .1( +) -HBx表达载体可为了解X基因与X蛋白对慢性乙型肝炎及肝癌发生的作用 ,为X基因与X蛋白的生物学功能研究提供可靠基因材料。 展开更多
关键词 HBV X基因 X蛋白 真核表达载体
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乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠的建立 被引量:1
16
作者 刘红 张钦宪 胡以平 《郑州大学学报(医学版)》 CAS 北大核心 2004年第3期398-400,共3页
目的 :建立乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠。方法 :构建乙型肝炎病毒核心基因真核表达载体pcDNA3 HBc ;采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核中 ,然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管 ;取其产 1 0d龄... 目的 :建立乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠。方法 :构建乙型肝炎病毒核心基因真核表达载体pcDNA3 HBc ;采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核中 ,然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管 ;取其产 1 0d龄子代鼠进行鉴定。结果与结论 :表达载体内切酶酶切及序列分析结果与预期一致 ;PCR鉴定转基因阳性小鼠比例为 2 5 % (6 / 2 4 )。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒核心基因 真核表达载体 转基因动物 小鼠
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小鼠H_2B-GFP真核表达载体的构建与鉴定 被引量:1
17
作者 孙文靖 马琳琳 +2 位作者 韩菲菲 任聪 傅松滨 《国际遗传学杂志》 CAS 2006年第1期15-19,共5页
目的构建小鼠H2B-绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体,为动态观察小鼠细胞中染色体的形态变化,从而进一步研究小鼠耐药细胞中双微体(DMs)的形成机制提供有效的分子工具。方法利用RT-PCR的方法获得小鼠H2B cDNA,以羧基端插入pcDNA3.1/CT-GFP-... 目的构建小鼠H2B-绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体,为动态观察小鼠细胞中染色体的形态变化,从而进一步研究小鼠耐药细胞中双微体(DMs)的形成机制提供有效的分子工具。方法利用RT-PCR的方法获得小鼠H2B cDNA,以羧基端插入pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO载体上,构建H2B-GFP真核表达载体,经菌液PCR、酶切及DNA测序鉴定插入片段大小、方向及序列的正确性,提取质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3进行鉴定。结果经菌液PCR、酶切和测序,证明小鼠H2B-GFP真核表达载体含有大小、方向及序列正确的H2B cDNA片段,转染NIH3T3后在细胞核中表达。结论成功构建了同时携带有G418筛选位点及多酶切位点的小鼠H2B-GFP真核表达载体,为其在小鼠体外培养细胞中的表达奠定了基础。 展开更多
关键词 H2B 绿色荧光蛋白 真核表达载体 小鼠
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乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及表达 被引量:1
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作者 吕婧 杨晓玲 +2 位作者 王惠珍 张栋 牛勃 《生物技术通讯》 CAS 2010年第3期336-339,共4页
目的:构建含有天然完整的乙型肝炎病毒(HBV)X基因序列的真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法:设计并合成HBV X基因的引物,用PCR方法从含完整HBV全基因的HepG2细胞中扩增X基因序列,并将其连接到真核表达载体pVAX-1上,酶切、PC... 目的:构建含有天然完整的乙型肝炎病毒(HBV)X基因序列的真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法:设计并合成HBV X基因的引物,用PCR方法从含完整HBV全基因的HepG2细胞中扩增X基因序列,并将其连接到真核表达载体pVAX-1上,酶切、PCR鉴定;用Triton X-114去除质粒内毒素后,采用电穿孔法将重组质粒pVAX-HBV X和空质粒pVAX-1分别转染SMMC-7721细胞,RT-PCR法检测HBV X基因mRNA的表达,Western印迹鉴定HBV X蛋白(HBx)的表达。结果:酶切和PCR鉴定证实pVAX-HBV X载体中包含完整的HBVX基因片段,该重组质粒转染的SMMC-7721细胞中HBV X基因mRNA及HBx蛋白的表达稳定。结论:构建了HBV X基因的真核表达载体,为X基因及其编码蛋白的生物学功能的研究提供了可靠的基因材料。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 X基因 真核表达载体
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维生素D受体野生型及FokⅠ突变型真核表达载体的构建 被引量:1
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作者 李宝群 梅爱敏 左彥珍 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2011年第7期1135-1137,共3页
目的:克隆人维生素D受体(VDR)全长,构建VDR野生型及FokⅠ突变型重组真核表达质粒。方法:提取总RNA,RT-PCR方法扩增将产物用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切后与pcDNA3.1(-)B-myc/his载体连接形成重组载体;对野生型VDR基因行定点诱变,构建突变... 目的:克隆人维生素D受体(VDR)全长,构建VDR野生型及FokⅠ突变型重组真核表达质粒。方法:提取总RNA,RT-PCR方法扩增将产物用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切后与pcDNA3.1(-)B-myc/his载体连接形成重组载体;对野生型VDR基因行定点诱变,构建突变型FokⅠVDR质粒。结果:重组质粒被酶切为两条带,一条为1300bp(代表人VDR),一条为5500bp(空载体);片段大小与理论值相符。测序结果与Genbank序列完全相同。结论:成功克隆了人VDR基因全长并成功构建了人野生型和突变型FokⅠVDR重组真核表达载体pcDNA3.1(-)B-myc/hishVDR,为进一步研究VDR基因变异与相关肿瘤易感性的分子机制奠定了实验基础。 展开更多
关键词 受体 骨化三醇 真核表达载体 pcDNA3.1(-)B-myc/hishVDR
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乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建 被引量:1
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作者 卢宏柱 徐友伦 《长江大学学报(自科版)(下旬)》 CAS 2009年第1期6-8,共3页
目的:构建HBVX基因与pCI-neo相融合的高效真核表达载体。方法:设计并合成HBVX基因的引物,以HBVDNA阳性血清PCR扩增得到HBVX基因全序列,将X基因连接到真核表达载体pCI-neo上后,酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等,鉴定所构建的... 目的:构建HBVX基因与pCI-neo相融合的高效真核表达载体。方法:设计并合成HBVX基因的引物,以HBVDNA阳性血清PCR扩增得到HBVX基因全序列,将X基因连接到真核表达载体pCI-neo上后,酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等,鉴定所构建的真核表达载体。结果:以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBVX基因大小相同,酶切也得到目的基因片段,测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论:成功构建了HBVX基因的真核表达载体,为进一步研究HBVX基因及其产物的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 X基因 真核表达载体
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