鸡marco稳转巨噬细胞系的构建与鉴定

旨在通过慢病毒表达系统构建稳定表达marco基因的HD11细胞系,为研究marco基因的抗病毒免疫功能提供重要工具。首先,以HD11细胞为模板,通过PCR扩增获得marco基因编码区序列,并将其克隆到慢病毒载体上,获得重组慢病毒质粒pLV3-CMV-MCS-Puro-marco;其次,利用四质粒慢病毒包装系统将重组质粒pLV3-CMV-MCS-Puro-marco与辅助质粒pLP1、pLP2、pMD2.G共转染至293T细胞进行慢病毒包装,构建含鸡marco基因的重组慢病毒。最后,用包装成功的重组慢病毒感染HD11细胞72 h后进行嘌呤霉素(2μg·mL^(-1))筛选,通过RT-qPCR检测marco基因表达后最终确认获得稳定表达鸡marco基因的HD11细胞系。本研究成功构建了稳定表达鸡marco基因的HD11细胞系,为后续深入研究marco基因的功能提供了重要基础。

cGAS稳定表达细胞系的构建及功能鉴定

天然免疫系统会在病毒入侵机体后的第一时间对其进行识别,并合成分泌I型干扰素和炎症因子等细胞因子参与宿主抗病毒免疫反应。天然免疫应答的启动主要通过机体自身表达的模式识别受体对病毒来源的病原相关分子模式的识别来实现。cGAS是目前最公认的胞质DNA受体,在各种类型的细胞和组织中广泛表达。猪肾细胞PK-15是猪病毒性疾病研究过程中应用十分广泛的工具细胞,然而本研究前期的转录组学数据显示,PK-15细胞中cGAS的转录水平极低,蛋白水平几乎检测不到PK-15细胞系中cGAS的表达,这极大程度的限制了PK-15细胞在猪病毒性疾病感染与免疫机制探究中的应用。本研究旨在构建一株稳定表达cGAS的PK-15细胞系。通过慢病毒包装系统,将cGAS基因整合到靶细胞基因组,经嘌呤霉素加压筛选,获得能够稳定表达cGAS的PK-15细胞系,并以猪伪狂病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)和猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)为模式病毒,对cGAS在抗DNA病毒感染过程中的作用进行了验证。结果表明,cGAS基因成功整合到宿主细胞PK-15基因组,重组细胞系PK-15-cGAS能够稳定表达cGAS蛋白;PRV和PPV感染PK-15-cGAS细胞能诱导产生更高水平的干扰素相关基因,在PK-15-cGAS细胞中PRV和PPV的复制受到明显抑制。这些结果表明,稳定表达cGAS的PK-15细胞系构建成功,它可用于猪病毒性疾病感染与免疫机制相关探究,为后续探究该类病毒免疫逃逸机制提供了良好的试验材料。

表达猴痘病毒表面蛋白A35R和E8L稳转细胞株的构建与应用

【目的】构建稳定表达猴痘病毒(Mpox virus,MPXV)表面蛋白A35R和E8L的稳转细胞株,用于定性或定量分析相应猴痘表面蛋白的抗体或互作分子与细胞表面A35R或E8L结合活性。【方法】运用基因重组技术,构建表达A35R或E8L的慢病毒表达载体,以HEK-293T作为宿主细胞,通过慢病毒转染技术形成稳定表达并定位在细胞表面A35R或E8L的稳转细胞株。采用Western Blot及细胞免疫荧光检测工程化细胞株中A35R或E8L的表达及蛋白定位情况,并运用流式细胞术验证稳转细胞与抗血清中多克隆抗体的结合能力。分别从表达A35R或E8L的稳转细胞中筛选出单克隆细胞株,并以单克隆稳转细胞作为工具定量分析商业化抗猴痘A35R或E8L单克隆抗体与细胞表面A35R或E8L的结合活性。【结果】成功构建稳定表达A35R或E8L并定位至细胞膜上的HEK-293T稳转细胞,经过单克隆化筛选,建立4株单克隆细胞株,其中2株稳定表达A35R(A35-2C10和A35-4E3)和2株稳定表达E8L(E8-6和E8-8)。筛选出的单克隆细胞在定量分析抗猴痘A35R或E8L的单克隆抗体结合活性方面显示出良好的拟合度。【结论】通过慢病毒转染技术构建的表达猴痘表面A35R或E8L的稳转细胞株可以作为通用研究工具,应用于抗A35与E8L中和抗体、核酸适配体或互作分子等相关分子与相应抗原结合活性的定性或定量分析。

EIF4A3 shRNA慢病毒载体的构建及其稳定转染细胞系的建立

目的:构建真核细胞翻译起始因子4A3(EIF4A3)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,建立Neuro-2a-EIF4A3-shRNA稳定转染细胞系。方法:通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库检索EIF4A3基因序列,设计并合成PCR鉴定引物,并将其连接至经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒GV493载体,构建GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒质粒,PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。将GV493空载质粒和GV493-EIF4A3-shRNA重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,分别为GV493对照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒,转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为空白组、GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组,空白组不作处理,GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组分别采用相应慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,使用10 mg·L-1嘌呤霉素筛选成功感染慢病毒的Neuro-2a细胞,荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞的生长状态和绿色荧光表达情况;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中EIF4A3 mRNA及蛋白表达水平。结果:PCR测序结果显示GV493-EIF4A3-shRNA重组质粒基因序列与设计合成的EIF4A3-shRNA序列一致,成功构建GV493-EIF4A3慢病毒载体。荧光显微镜观察可见HEK293T细胞荧光表达强烈,生长状态良好,慢病毒包装成功。GV493-对照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒的滴度均为2×10~8 TU·mL^(-1),GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组Neuro-2a细胞生长状态良好且表达绿色荧光,表明慢病毒感染稳定细胞系构建成功。RT-qPCR法,与空白组和GV493对照组比较,GV493-EIF4A3shRNA组Neuro-2a细胞EIF4A3mRNA表达水平明显降低(P<0.01)。Western blotting法,各组在相对分子质量49000处出现特异性条带,提示Neuro-2a细胞中EIF4A3蛋白表达成功;与空白组和GV493对照组比较,GV493-EIF4A3 shRNA组Neuro-2a细胞中EIF4A3蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:成功构建GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒载体,建立了Neuro-2a-EIF4A3-shRNA稳定转染细胞系,为EIF4A3在颅内动脉粥样硬化的作用机制研究提供了参考。

p38丝裂原激活蛋白激酶基因重组慢病毒载体的构建及其在建立人前列腺癌稳定细胞株中的应用

目的构建p38丝裂原激活蛋白激酶基因(MAPK)重组慢病毒载体并建立表达外源性p38基因的人前列腺癌稳定细胞株。方法采用限制性内切酶酶切、T4 DNA连接酶连接等方法,将EGFP/p38融合基因插入慢病毒载体pTYF-EF1α-IRES-EGFP中,构建启动子EF1α调控的EGFP/p38共表达慢病毒载体pTYF-EF1α-EGFP/p38,经酶切鉴定后,利用慢病毒三质粒系统,通过脂质体法转染包装细胞HEK 293T细胞,收集病毒上清后转导人前列腺癌DU145细胞株,经有限稀释法筛选重组EGFP/p38稳定细胞株,用Western blotting检测细胞总p38的表达,用计数法绘制细胞的生长曲线。结果经酶切鉴定,成功构建EGFP/p38重组慢病毒载体,并包装慢病毒,检测病毒悬液的滴度为4.7×106 TU/ml,利用此病毒悬液感染DU145细胞,成功筛选到EGFP/p38稳定表达细胞株,Western blotting显示该细胞株能稳定表达外源性EGFP/p38融合蛋白,这种过表达p38的细胞株的生长速度明显低于对照组。结论成功构建p38 MAPK重组慢病毒载体并建立了表达外源性p38 MAPK基因的稳定细胞株EGFP/p38-DU145,细胞内p38过表达能够抑制DU145细胞的增殖。

慢病毒感染方法构建稳定干涉PDRG1的HeLa细胞系

PDRG1(p53 and DNA-damage regulated 1)是实验室通过文库筛选发现的参与NF-kB信号通路调控的一个新基因。已知PDRG1在多种肿瘤中高表达,并参与p53信号通路;同时该基因受UV以及基因毒性等刺激调控。但其在NF-κB信号通路中作用尚未见报道,为了深入研究PDRG1对NF-κB信号通路的调控机理,构建了稳定干涉PDRG1的HeLa细胞系。选择了基于慢病毒载体pLKO.1的感染体系,该慢病毒体系可以同时感染分裂期与非分裂期的细胞,将目的基因干涉序列稳定整合至靶细胞基因组中;再经过抗生素压力筛选后在短时间内获得稳定干涉目的基因表达的细胞株。设计合成PDRG1干涉序列并克隆至pLKO.1载体,转染病毒包装细胞293TN后收集慢病毒上清感染HeLa细胞系,进一步经过嘌呤霉素压力筛选成功获得稳定表达PDRG1干涉序列的细胞株。该稳定细胞株的建立为PDRG1的功能研究提供了必要的实验工具。

BAD慢病毒载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的探讨促凋亡基因BAD（Bcl-2-associated death protein）重组慢病毒表达载体构建及其对肺癌A549细胞株增殖的影响。方法应用PCR法从含有目的基因的质粒pAV-MCMV-BAD-GFP中扩增BAD基因片段,克隆至慢病毒载体（pLVX-IRES-ZsGreen 1）,应用PCR、酶切和测序鉴定正确后,经病毒包装,感染A549细胞,经流式细胞仪筛选稳定表达细胞株,Western blot鉴定重组慢病毒感染的A549细胞BAD的表达。采用CCK-8试剂盒定点检测细胞的光密度（OD）值,分析BAD蛋白过表达对A549细胞增殖能力的影响。结果酶切鉴定和基因测序证实长度为507bp的BAD基因成功克隆至慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1;重组慢病毒通过感染A549细胞株和流式细胞仪筛选出单克隆细胞株BAD-A549,Western blot检测结果显示,细胞培养BADA549细胞可稳定过表达BAD蛋白。体外增殖结果显示,细胞培养120~144h,BAD组的OD值均较对照组低（P〈0.05）。结论成功构建了BAD重组慢病毒载体,获得稳定表达BAD的A549细胞株。BAD过表达能有效抑制A549细胞的增殖速度。

稳定表达人血红素加氧酶-1细胞系的建立及其功能鉴定

目的构建稳定表达人血红素加氧酶-1(HO-1)的细胞系,探讨内源性过表达HO-1对抗细胞氧化损伤的作用。方法 PCR扩增HO-1基因并将其克隆至改造的慢病毒载体pLentiLox3.7中,构建携带目的基因的重组质粒。用重组质粒转染HEK293T细胞,并用Western blot检测HO-1的表达。将重组质粒与慢病毒辅助质粒(plp1、plp2、VSVG)共同转染HEK293T细胞,包装有活力的慢病毒。用携带HO-1的慢病毒感染HEK293T细胞,筛选出能稳定表达目的基因的单克隆,并行Western blot检测HO-1的表达。将过氧化氢加入正常的及过表达HO-1的HEK293T细胞和人脐静脉内皮细胞,检测细胞内活性氧的含量。结果成功筛选出能稳定表达HO-1的单克隆细胞系并扩大培养,Western blot检测其HO-1的表达明显升高。加入过氧化氢后,过表达HO-1的HEK293T细胞和人脐静脉内皮细胞内的活性氧明显减少。结论成功构建了能稳定表达人HO-1的细胞系,内源性过表达HO-1能够对抗细胞的氧化损伤。

慢病毒介导的shRNA靶向干扰I2PP2A胃癌稳定细胞株的建立

背景与目的:蛋白磷酸酶2A抑制剂-2(inhibitor 2 of protein phosphatase 2A,I2PP2A)在包括胃癌的多种肿瘤中过度表达,提示其可能在胃癌的发生中发挥重要作用。为进一步探讨I2PP2A的功能及其在胃癌发生中的作用,建立稳定抑制I2PP2A基因表达的人胃癌BGC823细胞株。方法:筛选出I2PP2A基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA并构建p GLV2_sh RNA_I2PP2A慢病毒载体,酶切和测序鉴定正确后,经病毒包装,感染BGC823细胞,经嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株,通过实时定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)和蛋白[质]印迹法(Western blot)鉴定I2PP2A的表达。结果:重组慢病毒质粒经测序鉴定正确;RT-PCR和Western blot证实干扰I2PP2A后,BGC823细胞株中I2PP2A表达水平明显降低,抑制率约为90%。结论:成功构建了I2PP2A sh RNA慢病毒表达载体,建立了稳定抑制I2PP2A基因表达的人胃癌BGC823细胞株,为进一步研究I2PP2A在胃癌发生中的作用提供了可靠的细胞模型。

稳定表达3种猪腹泻病毒嵌合抗原的CHO细胞系构建与鉴定

为构建稳定表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪胃肠炎病毒(TGEV)和猪Delta冠状病毒(PDCoV)主要抗原的CHO细胞系,为猪病毒性腹泻三联疫苗的研发提供基础材料,本研究将PEDV的S基因的COE区域、TGEV和PDCoV的S基因的受体结合区域(RBD),通过同源重组的方式进行融合,克隆到慢病毒表达质粒pLV-EF1a-IRES-Puro中,包装得到重组慢病毒。使用重组慢病毒感染CHO细胞,经过嘌呤霉素和单克隆细胞筛选,基因水平和蛋白水平表达验证,成功构建了稳定表达3种猪腹泻病毒抗原融合蛋白的CHO细胞系,为进一步研制PEDV-TGEV-PDCoV的亚单位疫苗奠定了基础。

表达丙型肝炎病毒核心蛋白的人肝癌稳定转染细胞株的建立与鉴定

目的建立能表达丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV core)的人肝癌细胞SMMC-7721的稳定转染细胞株。方法构建含目的基因HCV core的重组质粒,转染HEK293T细胞,包装获得含ZsGreen和HCV core基因的慢病毒后,感染SMMC-7721人肝癌细胞,采用实时荧光定量PCR检测HCV core mRNA表达,采用免疫荧光细胞化学染色和Western blot法检测HCV core蛋白表达,筛选稳定表达HCV core的细胞株。结果质粒酶切和序列测定证实重组载体构建正确;慢病毒包装48 h后可见清晰ZsGreen表达,感染SMMC-7721细胞后筛选获得稳定转染的细胞株,实时荧光定量PCR检测到HCV core mRNA,免疫荧光细胞化学染色和Western blot法均检测出HCV core蛋白表达。结论成功构建了表达HCV core蛋白的SMMC-7721人肝癌细胞的稳定转染细胞株。

COPS3的稳定干涉细胞系建立及其在NLRP3炎症小体激活中的作用

COPS3(COP9 signalosome subunit 3)作为COP9信号复合体的第三个亚基,在多种恶性肿瘤中高表达。本实验室通过酵母双杂交系统筛选,发现COPS3与NLRP3(NOD-like receptor family,pyrin domain containing 3)存在相互作用。目前关于COPS3与NLRP3炎症小体的相关性未见文献报道。为了研究COPS3对NLRP3炎症小体的影响,利用慢病毒感染系统建立了稳定干涉COPS3的THP1细胞系。首先将COPS3的不同干涉序列片段稳定整合到THP1细胞中,通过嘌呤霉素压力筛选,应用实时定量荧光PCR(real time PCR)手段检测COPS3的干涉效果,最终确定成功建立干涉COPS3的稳定细胞株。在稳定敲低COPS3的细胞株中,发现NLRP3炎症小体的激活受到明显抑制。综上提示,COPS3能够正向调节NLRP3炎症小体的激活。

口腔鳞状细胞癌稳定过表达蛋白酶体激活因子PA28γ细胞株的构建

目的构建蛋白酶体激活因子PA28γ过表达的口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞稳转株,并验证其过表达PA28γ的效率。方法首先采用聚合酶链反应(PCR)克隆PA28γ基因至pLOV.CMV.cherry.2A.EF1a.PuroR慢病毒载体中,采用PCR和DNA测序比对分析进行鉴定;其次采用293T细胞包装病毒;然后采用病毒感染OSCC细胞构建PA28γ稳定过表达细胞株。最后利用免疫印迹技术检测OSCC细胞稳转株中PA28γ表达的水平。结果DNA测序结果显示成功构建PA28γ过表达慢病毒载体构建;荧光结果显示,PA28γ过表达慢病毒成功感染OSCC细胞,并呈现樱桃红色荧光;免疫印迹结果显示,构建的PA28γ稳定过表达细胞显著提高细胞中PA28γ表达水平。结论PA28γ过表达慢病毒载体能显著提高细胞中PA28γ蛋白表达水平,为进一步研究PA28γ对OSCC发生发展的影响及其机制提供了稳定的细胞转染载体。

猴源cathepsin基因shRNA文库及其稳定敲减细胞系的构建

目前关于组织蛋白酶(cathepsin)在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)生活周期中发挥功能的研究较少。为了探究宿主细胞中cathepsin在PRRSV吸附、入侵、脱壳、生物合成、组装以及释放过程中的作用,选取源于MA-104的非洲绿猴胚胎肾上皮细胞Marc145细胞系(对PRRSV易感);利用RNAi原理,构建了以pLKO.1为载体的cathepsin基因shRNA文库;并用puromycin筛选出稳定敲减cathepsin的细胞株。结果显示:本试验构建的cathepsin-shRNA文库包含45个克隆,涉及15种cathepsin基因,筛选出的稳定细胞株中相应cathepsin基因mRNA的表达量均有显著下降。这些细胞株的构建为进一步研究cathepsin在PRRSV生活周期中发挥的重要功能奠定了基础。

慢病毒介导的稳定表达人睾丸组织泛素连接酶TRIM69基因的细胞系的建立

目的利用改造的慢病毒表达系统构建表达人睾丸组织新的泛素连接酶TRIM69基因的稳定细胞系。方法采用RT-PCR方法从人胚肾细胞系HEK293T cDNA中扩增TRIM69基因及其缺失RING结构域的突变体,将其克隆至改造的plentilox3.7慢病毒载体中。将慢病毒质粒pLenti-TRIM69或其突变体与慢病毒辅助质粒(plp1,plp2,VSVG)共转染HEK293T包装细胞,产生有活性的病毒。包装后的重组慢病毒感染HEK293细胞,Western blot检测确认TRIM69及其突变体蛋白的表达。结果经Western blot检测证实,成功建立了稳定表达TRIM69基因及其突变体的293细胞系。结论利用慢病毒成功制备稳定表达TRIM69基因及其突变体的293细胞系,这些细胞为TRIM69生物学功能的研究提供了平台。

RHBDF2-shRNA慢病毒载体的构建和Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系的建立

目的:构建RHBDF2-shRNA慢病毒载体,建立Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,并检测稳转细胞株中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平。方法:根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成针对RHBDF2基因干扰靶点的shRNA-oligo,退火后将其连接到经Eco RⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒载体FV067-RNAi-EGFP-Puro中,构建FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒,通过PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。使用HEK 293T细胞和Neuro-2a细胞作为实验材料,FV067 Vector作为对照组,FV067-RHBDF2-shRNA作为实验组。通过Lipofectamine 2000将FV067 Vector和FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒分别与慢病毒辅助质粒psPAX2和pMD2G共转染至HEK 293T细胞中,转染48 h收集并纯化慢病毒,分别将对照组FV067 Vector和实验组FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒在感染复数(MOI)为50时感染Neuro-2a细胞,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达,采用2 mg·L^-1嘌呤霉素筛选出RHBDF2基因稳定沉默的细胞系。实时荧光定量PCR法检测2组细胞中RHBDF2 mRNA表达水平,免疫印迹法检测2组细胞中RHBDF2蛋白表达水平。结果:PCR和测序,RHBDF2-shRNA慢病毒载体中的干扰序列与设计合成的RHBDF2-shRNA-oligo序列完全一致。FV067 Vector慢病毒的滴度为5×10^8 TU·mL^-1,FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒的滴度为3×10^8 TU·mL^-1。实时荧光定量PCR检测,实验组稳转细胞株中RHBDF2 mRNA表达水平比对照组降低了52.26%(t=11.44,P=0.0076)。免疫印迹法检测,与对照组比较,实验组RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2蛋白表达水平降低了47%(t=6.374,P=0.0078)。结论:成功构建了FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒载体并建立了Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,且Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平明显降低。

DPF2干扰慢病毒感染人胚胎干细胞建立稳定细胞系

目的对DPF2干扰慢病毒感染H9细胞,获得稳定的人胚胎干细胞克隆细胞系的方法学探讨。方法将各型带有GFP荧光标签的DPF2-RNAi慢病毒导入H9细胞中,嘌呤霉素筛选前后,相差和荧光显微镜下观察细胞形态和细胞感染效率;Western blot鉴定感染后的各组H9细胞系内DPF2蛋白表达水平。结果成功获得慢病毒感染后的H9稳定细胞系,成功筛选出#25540 DPF2-RNAi慢病毒,其沉默或敲低H9细胞的效率更高,稳定性更好。结论应用携带DPF2-RNAi的慢病毒感染人胚胎干细胞,使目标基因沉默,探索建立稳定细胞系的方法,为进一步研究提供细胞模型。

稳定表达PDCoV-S和RBD蛋白的293T细胞系构建与免疫原性评价

为构建稳定表达猪δ冠状病毒(PDCoV)S和RBD蛋白的293T细胞系,获得PDCoV S和RBD蛋白。本研究将优化合成的PDCoV S蛋白全长基因及其RBD的表达质粒进行双酶切鉴定,将重组质粒pLV-S-Puro、pLV-RBD-Puro、psPRX2、pMD2.G同时转染293T细胞中进行慢病毒包装,收集上清感染293T细胞,经嘌呤霉素初筛得到的多细胞克隆,进一步通过终点稀释法筛选获得稳定表达PDCoV S和RBD蛋白的单克隆293T细胞系,通过Western blot检测蛋白表达,用纯化的PDCoV S和RBD蛋白分别免疫BALB/c小鼠,对重组蛋白进行免疫原性检测。结果表明,稳定表达PDCoV S和RBD蛋白的293T细胞系构建成功,获得了重组慢病毒,纯化PDCoV S和RBD重组蛋白均可以诱导小鼠产生较高的IgG抗体(S:1.2;RBD:0.9),中和抗体水平分别达1∶128和1∶64。本研究构建的293T细胞系能稳定表达PDCoV S和RBD蛋白,为进一步研制PDCoV亚单位疫苗奠定了基础。

稳定表达PSMB9-eGFP-His蛋白的THP-1细胞系建立及免疫蛋白酶体活性检测

泛素/蛋白酶体系统(ubiquitin/proteasome system,UPS)在调控细胞内蛋白质稳态过程中发挥重要功能,UPS中蛋白酶体的催化活性受β1(PSMB6)、β2(PSMB7)和β5(PSMB5)亚基调控,在干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、炎症反应、氧化应激等条件诱导下,β1、β2和β5可被相应的β1i(PSMB9)、β2i(PSMB10)和β5i(PSMB8)替换,组装形成免疫蛋白酶体(immunoproteasome)。与标准蛋白酶体相比,免疫蛋白酶体具有更强的免疫调节作用,如加工递呈MHCⅠ抗原、调节促炎细胞因子的产生及T细胞分化、增殖等。免疫蛋白酶体的异常聚集会导致帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化等神经退行性疾病的发生。为探究PSMB9在细菌感染后发挥的功能,本研究通过构建过表达PSMB9-eGFP-His的慢病毒质粒,利用三质粒系统转染HEK293T包装慢病毒,嘌呤霉素筛选,获得稳定表达PSMB9融合蛋白的人髓系白血病单核细胞THP-1细胞系,利用蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)及荧光显微镜验证了PSMB9融合蛋白的表达,通过实时荧光定量PCR(quantitative PCR,q PCR)计算了稳转细胞系中PSMB9-eGFP基因的拷贝数。免疫荧光结果发现eGFP-His不会影响PSMB9的亚细胞定位,镍柱亲和纯化实验证实PSMB9融合蛋白可组装至20S免疫蛋白酶体中,且具有底物切割活性。上述结果证明PSMB9-eGFP基因成功整合入THP-1细胞基因组并稳定表达,可用于探究PSMB9亚基在活细胞模型中不同感染条件及疾病进程中的细胞定位、动态表达和活性的变化,并为其他2个免疫蛋白酶体亚基PSMB8和PSMB10的稳转细胞系构建提供了参考。

Wnt蛋白拮抗剂Frzb的cDNA克隆、重组慢病毒构建以及稳定表达细胞株的建立

Wnt信号通路的异常活化与人类多种恶性肿瘤的发生密切相关,为探索作为Wnt蛋白拮抗剂sFRP(Secreted frizzled related protein)家族成员之一的Frzb/sFRP3在肝癌细胞中的抗癌潜力,本研究主要通过RT-PCR以及慢病毒表达系统进行了Frzb的cDNA克隆、重组慢病毒构建以及肝癌稳定表达细胞株的建立.从人正常肝细胞HL-7702中提取总RNA,通过RT-PCR获得Frzb cDNA片段并经测序证实;与此同时,将Frzb cDNA分别构建至以绿色荧光蛋白或嘌呤霉素抗性为报告基因的慢病毒真核表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1-Frzb及pLVX-Puro-Frzb,通过酶切和测序获得正确的慢病毒重组表达质粒;其次,通过Lenti-X?Lentiviral Expression Systems将慢病毒重组表达质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共转染HEK293T细胞,48 h后制备重组慢病毒悬液,随后感染HEK293T细胞,分别通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达以及Western blot验证了Frzb(FLAG标签)在细胞中的正确表达;最后,将Frzb重组慢病毒悬液感染肝癌HepG2细胞,经2μg/mL嘌呤霉素筛选成功地获得了稳定表达Frzb的细胞株.以上结果表明慢病毒表达体系对Wnt信号通路的分子靶向药物研究具有重要价值.