BAG4过表达重组质粒构建及转染结肠癌SW480细胞的鉴定

目的构建BAG4(Bcl-2-associated athanogene)基因过表达重组质粒,转染结肠癌细胞株,并对其是否转染成功进行鉴定。方法 Real-time聚合酶链反应(PCR)检测和筛选6株结肠癌细胞BAG4m RNA表达。采用全基因合成法合成BAG4编码区序列,克隆入p EGFP-C1载体末端,构建重组质粒p EGFP-Cl-BAG4并DNA测序,以500ul脂质体质粒复合物瞬时转染SW480细胞,Western blot(鼠抗人BAG4单抗1:500)、RT-PCR等检测目的基因表达效率。结果 6株细胞中,HT29和SW480细胞BAG4 m RNA及蛋白水平最低。测序结果表明BAG4重组质粒构建成功。瞬时转染SW480细胞后,BAG4 m RNA分别升高约100倍,并BAG4蛋白表达也明显升高。结论成功构建BAG4基因过表达重组质粒,并有较高的转染水平,为进一步的研究提供了条件。

MicroRNA-1对肝癌细胞BAG4表达的影响

目的观察microRNA-1(miR-1)对肝癌细胞系Hep3B死亡结构域沉默子(BAG4)的表达及细胞凋亡的影响。方法 Western blot检测肝癌组织中BAG4蛋白表达情况;将过表达miR-1的质粒转染肝癌细胞Hep3B,分别用RT-qPCR及Western blot检测BAG4 mRNA和蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡;生物信息学软件分析miR-1和BAG4 3’UTR作用关系。结果 BAG4蛋白在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织;Hep3B转染miR-1过表达质粒后,相较于阴性对照(NC)组,BAG4mRNA和蛋白水平的表达均有所降低;早期凋亡率明显增高。生物信息学分析提示BAG4是miR-1潜在靶基因。结论 miR-1可以诱导肝癌细胞Hep3B凋亡,其作用可能和抑制BAG4表达有关。

微小RNA-4463对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和侵袭的影响

目的研究微小RNA-4463(miR-4463)对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移、侵袭的影响以及机制。方法收集延安大学附属医院2017年12月至2019年6月整形手术病人40例,每例切除瘢痕疙瘩组织1个以及邻近正常皮肤组织1个,利用定量聚合酶链反应(qPCR)检测人正常成纤维细胞和瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR-4463的表达量;将miR-4463模拟物对照质粒和miR-4463模拟物分别在Lipofectamine 2000介导下转染入瘢痕疙瘩成纤维细胞,分为miR-NC组和miR-4463组;常规培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞作为对照;qPCR检测转染后miR-4463的表达量;qPCR检测上调miR-4463对瘢痕疙瘩纤维化相关基因Col1 A1、Col 3 A1表达的影响;细胞计数试剂盒(CCK-8)检测上调miR-4463对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响,Transwell实验检测细胞的迁移、侵袭;采用TargetScan软件预测miR-4463与B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)相关的致病基因BAG4的靶向关系,双荧光素酶报告基因进一步进行验证。结果miR-4463在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达量较人正常成纤维细胞显著降低[(0.218±0.036)比(1.000±0.071),P<0.05];与对照组相比,转染miR-4463模拟物明显增加瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR-4463的表达量[(1.000±0.073)比(3.313±0.242),P<0.05];上调miR-4463显著抑制瘢痕疙瘩纤维化相关基因Col 1 A1[(1.000±0.065)比(0.334±0.010)]、Col 3 A1[(1.000±0.070)比(0.301±0.008)]的表达量(P<0.05);上调miR-4463抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖[(0.836±0.081)比(0.656±0.072),P<0.05],降低其迁移[(153.269±12.471)个比(82.363±7.254)个]、侵袭细胞数[(73.623±6.451)个比(36.459±3.235)个](P<0.05);BAG4是miR-4463下游靶基因。结论miR-4463可能通过调控BAG4抑制细胞外基质中纤维化相关胶原基因的表达,抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移、侵袭。

CHOP疗法对T细胞淋巴瘤Hut 78和HH细胞环状RNA circ＿001569及其下游蛋白表达的影响

目的探索CHOP疗法对T细胞淋巴瘤细胞中环状RNA circ_001569及其下游功能蛋白的影响。方法分别采用CHOP疗法中的4种化疗药物[环磷酰胺(1μmol/L)、羟基柔红霉素(0.2μmol/L)、长春新碱(1μmol/L)、泼尼松(1μmol/L)]处理T细胞淋巴瘤Hut78和HH细胞,以常规培养细胞作为对照。分组处理24 h后检测各组细胞增殖情况,采用特异性逆转录环状RNA和茎环法逆转录miRNA,实时定量PCR检测各组circRNA_001569、miR-145和BAG4 mRNA的表达水平,Western Blot检测BAG4蛋白表达。结果 4种药物均可显著抑制Hut78细胞和HH细胞增殖(P<0.05)。经过羟基柔红霉素、长春新碱处理后,Hut78和HH细胞circRNA_001569的表达水平降低,其下游分子miR-145表达上调,BAG4 mRNA和蛋白表达下调。结论 CHOP疗法治疗T细胞淋巴瘤的过程中,环状RNAcircRNA_001569可能起到了重要的调控作用。