BAG4过表达重组质粒构建及转染结肠癌SW480细胞的鉴定

目的构建BAG4(Bcl-2-associated athanogene)基因过表达重组质粒,转染结肠癌细胞株,并对其是否转染成功进行鉴定。方法 Real-time聚合酶链反应(PCR)检测和筛选6株结肠癌细胞BAG4m RNA表达。采用全基因合成法合成BAG4编码区序列,克隆入p EGFP-C1载体末端,构建重组质粒p EGFP-Cl-BAG4并DNA测序,以500ul脂质体质粒复合物瞬时转染SW480细胞,Western blot(鼠抗人BAG4单抗1:500)、RT-PCR等检测目的基因表达效率。结果 6株细胞中,HT29和SW480细胞BAG4 m RNA及蛋白水平最低。测序结果表明BAG4重组质粒构建成功。瞬时转染SW480细胞后,BAG4 m RNA分别升高约100倍,并BAG4蛋白表达也明显升高。结论成功构建BAG4基因过表达重组质粒,并有较高的转染水平,为进一步的研究提供了条件。

pcDNA3.1/DLC-1重组质粒的构建及其在HT-29细胞中的表达

目的构建和表达DLC-1(deleted in liver cancer)基因重组质粒。方法用PCR法得到DLC-1基因片段,此基因片段带有XbaⅠ和BamHⅠ两个酶切位点,然后将此片段和真核表达载体pcDNA3.1连接,转化大肠杆菌DH5a,利用脂质体介导将pcDNA3.1/DLC-1重组质粒转染到结肠癌HT-29细胞中,再用RT-PCR法检测重组质粒的表达。结果重组质粒经XbaⅠ和BamHⅠ双酶切和测序与DLC-1基因序列一致;利用脂质体介导将pcDNA3.1/DLC-1重组质粒导入HT-29细胞,获得了DLC-1基因的表达。结论成功构建pcDNA3.1/DLC-1重组质粒并在HT-29细胞内表达。