Balb/c乳鼠心肌细胞的分离和体外培养方法的优化

目的探讨Balb/c乳鼠心肌细胞分离和培养方法,优化出Balb/c乳鼠心肌细胞分离和培养的方法。方法取乳鼠心脏,采用胰酶和胶原酶Ⅱ消化方法分离乳鼠心肌细胞,比较消化次数和消化时间对原代乳鼠心肌细胞培养的影响。结果原代培养的Balb/c乳鼠心肌细胞生长迅速、自行搏动,细胞形态完整,细胞内肌丝、线粒体清晰。分离细胞时消化次数最好控制在不多于6次,每次消化时间不超过20min。2h差速贴壁可以提高心肌细胞纯度,经肌动蛋白鉴定,心肌细胞达94.6%。结论本研究优化了分离和原代培养Blab/c乳鼠心肌细胞的方法。

Balb/C乳鼠小脑Purkinje细胞原代培养方法

目的建立一种简单、有效的Balb/C乳鼠小脑Purkinje细胞原代培养方法,并初步研究其细胞电生理特性。方法钝性分离生后24h内的乳鼠小脑,采用低浓度胰蛋白酶加机械吹打法获得单细胞悬液,然后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养,24h候更换为1%N2+1%T3+1%谷氨酰胺的DMEM/F12维持培养,3-5d天后进行细胞免疫荧光染色,7-9d天后用全细胞膜片钳单通道法记录钙电流。结果该方法培养的神经元形态典型,细胞学鉴定阳性率高(>70%),并能记录到钙通道电流。结论该方法取材容易,操作简便,且培养出的原代Purkinje细胞生长状态较好,神经元的活性较高,可用于电生理研究。

Cox A16型手足口病BALB/c乳鼠模型的建立

目的建立3日龄BALB/c乳鼠Cox A16型手足口病动物模型,并进行免疫、病理学研究。方法3日龄BALB/c乳鼠腹腔注射感染Cox A16型毒株,测定其50%致死剂量(LD50),观察其14 d内存活天数、临床症状打分。采用3LD50病毒攻毒,并观察其14 d内感染程度、体重变化、死亡数,计算平均存活天数、死亡率,至感染第6天发病达到高峰时取材,采用CBA法检测血清中MCP-1、MIP-1α、G-CSF含量,采用实时荧光定量RT-PCR法检测后肢肌肉组织、心脏、脑、肠病毒载量,采用HE染色观察后肢肌肉、脑病理病变情况。结果Cox A16毒株感染3日龄BALB/c乳鼠,出现活动减少、后肢麻痹瘫痪、体重减轻、死亡,其病毒毒力为每毫升56 LD50。感染后14 d内,与正常对照组比较,模型组乳鼠生存天数、死亡率、临床感染评分、体重,均具有显著性差异(P<0.01)。感染后6d,血清中MCP-1、G-CSF含量均显著性升高(P<0.01)。后肢肌肉组织、心脏、脑、肠病毒载量较正常组均显著升高(P<0.01),其中后肢肌肉组织病毒载量最高。HE染色病理观察表明,后肢肌肉组织有大面积萎缩、炎症,脑组织神经细胞有不同程度的萎缩。结论成功构建了3日龄BALB/c乳鼠Cox A16型手足口病动物模型,为COX A16型手足口病药物评价及机制研究奠定基础。

猴源轮状病毒SA11株Balb/c乳鼠动物模型的建立

建立轮状病毒(rotavirus,RV) SA-11株Balb/c乳鼠动物模型,研究其发病机制,为后续疫苗保护性评价奠定基础。用不同剂量的SA11毒株单次灌胃感染7 d龄的Balb/c乳鼠,于感染后不同时间点观察其腹泻、活动能力及精神状态等生理指标,并解剖乳鼠,取其心、肝、脾、肺、小肠及肾等组织。免疫组化和免疫荧光检测轮状病毒抗原分布,HE染色观察小肠形态学改变,组织细胞原位凋亡检测观察攻毒后小肠绒毛细胞的凋亡情况。研究发现,高剂量和中剂量攻毒组在攻毒24 h后全组乳鼠即可发生明显腹泻,对照组和低剂量组乳鼠无腹泻发生。攻毒72 h后解剖乳鼠,高、中剂量攻毒组的乳鼠肠道可见明显充血及肠胀气,病理切片HE染色显示小肠绒毛发生大量空泡变性及小肠绒毛顶端破损,小肠绒毛原位凋亡检测可见其顶端细胞发生大量凋亡,免疫荧光检测发现在乳鼠的小肠绒毛顶端及肾脏的肾小球位置均有RV抗原分布。成功构建了猴源轮状病毒SA11株Balb/c乳鼠动物模型,研究发现轮状病毒除感染乳鼠小肠绒毛导致其病变破损发生腹泻外,还可感染肾脏等肠道外器官,引起肠道外感染。

γ-干扰素干预对乳鼠感染轮状病毒后肝损伤程度的影响

目的:检测肝脏核因子(NF)-κB的表达,评估γ-干扰素(IFN-γ)对乳鼠感染轮状病毒(RV)后的作用。方法:将乳鼠分为肠道外感染对照组、IFN-γ大小剂量干预组。腹腔注射RV建立2日龄RV肠道外感染模型。用大小剂量(2μg,0.2μg)IFN-γ在BALB/C乳鼠背部皮下注射3 d。模型建立后第5天取材,观察肝脏病理组织学变化,蛋白质印迹法和免疫组织化学法检测肝脏NF-κB表达。结果:IFN-γ小剂量干预组乳鼠肝脏病理损伤评分较肠道外感染对照组差异无统计学意义(P>0.05)。IFN-γ大剂量干预组乳鼠肝脏病理损伤评分均较肠道外感染对照组和IFN-γ小剂量干预组明显增高(P<0.01)。蛋白质印迹法和免疫组织化学法显示IFN-γ大小剂量干预组NF-κB表达随IFN-γ剂量的增加而增加(P<0.01)。结论:IFN-γ能刺激NF-κB的表达。肝脏的病理损伤与NF-κB在肝脏的表达量相关。

C5a/C5aR信号在微小隐孢子虫感染中的免疫调节作用研究

旨在探究C5a/C5aR信号在微小隐孢子虫感染过程中对宿主CD4+T细胞免疫反应的调控作用。本研究以微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)为研究对象,以BALB/c乳鼠和C5aR抑制BALB/c乳鼠为感染模型,应用实时荧光定量PCR和免疫组织化学技术检测了C.parvum感染前后乳鼠回肠组织中C5aR的表达变化,利用实时荧光定量PCR检测了隐孢子虫HSP70基因和CD4+T细胞亚群(Th1、Th2、Th17细胞和Treg细胞)主效应细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β)的转录变化,并通过病理组织切片观察乳鼠回肠黏膜的损伤情况。结果显示:与对照组乳鼠相比,C.parvum感染可以引起乳鼠回肠组织中C5aR的mRNA和蛋白表达水平显著上调(P<0.05),以及IFN-γ表达水平显著上调(P<0.05);与C.parvum感染组乳鼠相比,C5aR抑制剂处理可引起C.parvum感染乳鼠回肠组织中Th1细胞、Th2细胞和Treg细胞的主效应细胞因子IFN-γ、IL-4和TGF-β显著下调表达(P<0.05),以及Th17细胞主效应细胞因子IL-17显著上调表达(P<0.05)。病理学观察发现,抑制C5aR能显著改善C.parvum感染引起的乳鼠回肠组织的绒毛直径和黏膜厚度变化(P<0.05),但不能改善绒毛长度、绒毛长度与隐窝深度比值。隐孢子虫HSP70基因的mRNA水平检测发现,抑制C5aR能显著影响C.parvum在回肠组织中的增殖(P<0.05)。C5a/C5aR信号可能通过动态调节CD4+T细胞亚群主效应细胞因子的表达来参与宿主与隐孢子虫相互作用的过程,为深入理解隐孢子虫与宿主的互作机制提供了参考。

B组柯萨奇病毒对心肌细胞感染模式的研究

目的观察B组柯萨奇病毒(Coxsackie virus B,CVB)在原代心肌细胞中的感染特点,从而研究CVB对心肌细胞的致病机制。方法原代培养Balb/c乳鼠心肌细胞,并获得纯化的心肌细胞。使用B组柯萨奇病毒嗜心肌毒株3型(CVB3m)攻击原代心肌细胞,观察病毒感染心肌细胞后心肌细胞的细胞病变、超微结构和心肌酶的变化。结果成功原代培养了Balb/c乳鼠心肌细胞。心肌细胞在病毒感染后,细胞病变(CPE)不明显,与在HeLa等细胞中的典型CPE不同。心肌细胞在CVB3m感染后保持细胞形态和博动超过2周时间。电镜显示心肌细胞结构正常,细胞器数量增加,在心肌细胞胞质中可见晶格样病毒颗粒排列。培养细胞的上清液中心肌酶升高。结论CVB在原代心肌细胞中表现为持续感染,CVB在心肌细胞中的致病机制不同于HeLa细胞。

疏风解毒颗粒防治手足口病的体内外药效学研究

目的:通过观察疏风解毒颗粒在体内对手足口病病毒EV71感染BALB/c乳鼠模型的保护作用和在体外对EV71等肠道病毒的抑制作用,评价疏风解毒颗粒防治手足口病的药效。方法:采用疏风解毒颗粒3岁儿童临床2倍、等倍和1/2倍剂量(14.08,7.04,3.52 g.kg-1)分别对手足口病病毒EV71 H株感染的BALB/c乳鼠手足口病动物模型进行预防性给药(ig,3 d)和治疗性给药(ig,5 d),观察乳鼠感染的严重程度、死亡数,计算动物死亡率和生命延长率;采用疏风解毒颗粒在体外对Vero细胞无明显毒性的5个剂量,对人手足口病病毒EV71 H株,柯萨奇病毒B3株,B4株,B5株的致Vero细胞病变的抑制作用进行观察。结果:疏风解毒颗粒对手足口病病毒EV71感染的乳鼠模型具有明显的预防和治疗作用,可降低感染程度和死亡率,具有明显的保护和延长生命的作用;疏风解毒颗粒在无明显毒性的浓度下,在体外对人手足口病病毒EV71 H株、CoxB3株、CoxB5株均具有明显的抑制作用。结论:疏风解毒颗粒在体内外均具有较好的防治手足口病的作用。

小儿热速清糖浆防治手足口病的体内外药效学研究

手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是由肠道病毒感染引起的一种儿童常见传染病,全球普遍高发,严重威胁患儿健康。目前缺乏有效治疗药物,主要进行对症治疗,因此,研发高效的抗HFMD相关肠道病毒的药物和治疗方法十分重要。本研究应用细胞和小动物感染模型评价了小儿热速清糖浆(RSQ)对肠道病毒A组71型(Enterovirus A71,EV-A71)致病能力的抑制作用。体内实验中,小儿热速清糖浆设计66ml/(kg·d^(-1))、33ml/(kg·d^(-1))、16.5ml/(kg·d^(-1))三个剂量组,分别对EV-A71 H株感染的BALB/c乳鼠进行预防性和治疗性给药,观察乳鼠感染的严重程度及死亡数、动物死亡率、死亡保护率以及生命延长率。体外实验中,采用CPE法观察小儿热速清糖浆对EV-A71 H株、EV-A71 BrCr株、柯萨奇病毒(Coxsackievirus,Cox)B_3株、Cox B_4株、Cox B_5株所致细胞病变的抑制作用。体内试验结果显示,预防性和治疗性给予小儿热速清糖浆后,中、小剂量组乳鼠的感染程度积分及死亡率均明显降低,并可以延长动物的存活时间,大剂量组未表现出明显的药效作用。体外实验结果显示,小儿热速清糖浆对EV-A71 H株、Cox B_5株、EV-A71 BrCr株及Cox B_3株所致RD或Hep-2细胞病变具有一定的抑制作用,治疗指数分别为5.77、5.01、3.98、2.30。以上结果表明,小儿热速清糖浆对EV-A71 H株感染的手足口病乳鼠模型具有显著的预防和治疗作用,在体外对手足口病致病病毒EV-A71 H株、EV-A71 BrCr株、Cox B_3及Cox B_5株均有明显的抑制作用。