TA29-Barnase基因导致抗虫转基因欧洲黑杨雄性不育的研究

取在１／２ＭＳ＋ ＮＡＡ０－０２ ｍｇ／Ｌ 培养基中发育４ ～６ 周的欧洲黑杨转Ｂｔ 基因植株１５ｎ１９２ 试管苗幼叶，在ＭＳ＋ ＢＡ０－２ ｍｇ／Ｌ＋ ＮＡＡ０－０２ ｍｇ／Ｌ培养基中培养１６ｈ ，分别用基因枪法和叶盘法转化ＴＡ２９Ｂａｒｎａｓｅ嵌合基因，其Ｂａｒｎａｓｅ 基因的转化率依次为１６－１ ％ 和２３ ％ ，再生株数分别为１７５／１２ 和７１／１０ 。试验表明，选择发育适宜的叶片，利于目的基因转化后的植株再生。进一步用ＳＤＳ 法提取转基因植株总ＤＮＡ，经ＰＣＲ 检测表明：转化植株基因组中扩增出的ＤＮＡ 片段与Ｂａｒｎａｓｅ 基因的大小一致；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ 分析出转化后的欧洲黑杨基因组中携有Ｂａｒｎａｓｅ 基因片段，进行Ｄｏｔ Ｂｌｏｔ 检测，转化植株有一明显的杂交斑，并证实为阳性转化植株，并通过试管培养，结合林木常规育种方法，获得了转Ｂａｒｎａｓｅ 基因的抗虫欧洲黑杨转基因植株。

以基因枪介导获转ps1-barnase基因的工程雄性不育水稻植株

以ps1-barnase(brn)为目的基因,pHcintG(PG)为选择/标记基因进行共转化,以PDS-1000-氦气基因枪介导,将brn及PG基因转化到水稻台北309及秋光的核DNA中,得到了转ps1-barnase基因的工程雄性不育植株。以悬浮细胞作为基因枪轰击的靶材料,转化植株再生频率较初级愈伤组织的为高。转brn基因植株的其他主要性状与供体亲本无显著差异,但却表现不育。其不育的程度在不同的植株之间表现不同。在转brn基因植株中观察到全不育(占全部brn阳性植株的40.6％)、高不育(占15.6％)及半不育的个体(占43.7％)。全不育的转基因植株自交完全不能结实(结实率为零),除个别植株外,花粉完全不被I-KI染色;而人工授以正常的花粉则可以获得杂交种子。而brn基因的阴性植株及未进行转化的对照植株则完全可育,表明转基因植株之雄性不育乃brn基因所致。结果表明,brn基因在水稻中是完全可以正常表达的,其表达的时期推测在花粉母细胞减数分裂前至花粉形成之间的整个时期。

根癌农杆菌介导Barnase基因转化‘美人指’葡萄的研究

以‘美人指’葡萄离体叶片及叶柄为农杆菌介导转化Barnase基因的受体,对农杆菌侵染时间、共培养时间、预培养时间、卡那霉素选择压以及头孢霉素浓度等因素进行了研究。结果表明:最佳的农杆菌介导‘美人指’葡萄遗传转化体系为农杆菌侵染4 min,共培养3 d,预培养3 d,卡那霉素选择压3.0 mg.L-1,头孢霉素质量浓度250 mg.L-1。采用此体系对‘美人指’葡萄进行转化,共获得了12株抗性苗,农杆菌感染后的不定芽再生率为1.78%。利用GUS组织化学染色、PCR扩增的方法进行检测,结果表明,其中只有2株GUS染色呈阳性,阳性率为16.67%;有3株通过了PCR检测,初步证实Barnase基因已经整合进入‘美人指’葡萄基因组中。

农杆菌介导Barnase基因转化番茄

以雄性不育基因barnase作为目的基因、抗除草剂溴苯腈的bxn基因作为选择标记基因 ,利用下胚轴和子叶做外植体与农杆菌共培养方法 ,在番茄的两个品种佳粉 1号和佳粉 15号中 ,分别获得 38和 15株溴苯腈的抗性株 .PCR检测结果表明 ,抗性株含barnase基因 ,且抗性株的花粉完全丧失活力 。

转基因抗草丁膦油菜籽中Barnase基因的实时荧光定量PCR检测

利用荧光定量PCR技术,对进口抗草丁膦油菜籽中的Barnase基因进行了定量检测,分别建立了抗草丁膦油菜籽参照样品外源Barnase基因和内标准HMG基因C t值与模板量之间的标准曲线和线性回归方程,运用所建立起来的方法对14批油菜籽样品进行了定量分析。

TA29-Barnase转基因雄性不育芥菜的获得

将烟草TA29花药绒毡层特异启动子驱动下的核糖核酸酶Barnase基因,利用农杆菌介导的方法导入渝丰榨菜幼苗下胚轴中,获得了彻底败育的雄性不育植株。细胞学观察结果显示:转基因芥菜植株的花药绒毡层细胞提前降解,花粉母细胞退化,成熟花药中无正常花粉粒产生。转基因芥菜植株除了花药瘦小、开花后无花粉散出、自交不能正常结籽外,还出现了花朵变小、雌蕊变短、种荚变短、结籽量下降的现象。

核糖核酸酶barnase基因的克隆策略研究

比较了目前报道的两种克隆barnase基因的方法——barnase基因的单独克隆和barstar抑制剂基因保护下的barnase基因克隆.分别利用4种质粒进行barnase基因的单独克隆时,得到的阳性克隆数量少.对其中15个阳性克隆进行了测序分析,结果有5个克隆出现碱基缺失,1个克隆出现碱基增加,其余9个克隆则出现氨基酸突变,均未得到氨基酸序列完全正确的克隆.进一步分析表明这些突变的位点大多直接与保持barnase蛋白的活性位点相关.而在克隆barnase基因之前,预先将barstar基因连同其自身启动子加载于待克隆载体上,随后再进行barnase基因克隆时则容易得到与报道的barnase基因序列完全一致的阳性克隆.分析认为由于barnase基因单独存在时有一定数量的蛋白表达,宿主菌大肠杆菌无法忍受而通过某种方式造成其barnase发生相应突变而无法实现barnase基因的单独克隆.因此有必要利用barstar基因的保护来进行barnase基因相应的克隆和遗传操作.

雄性不育基因barnase对西瓜的遗传转化

将带有雄性不育基因、除草剂基因及卡那霉素抗性基因的质粒pBI-TBSbar通过冻融法导入根癌农杆菌菌株LBA4404中,采用农杆菌介导法转化西瓜品种(京欣一号,亲本自交系C-1),获得具有卡那霉素抗性植株8株,PCR,Southern blot检测表明,外源片段已经整合到西瓜基因组中.

BcA9-Barnase转基因雄性不育烟草的获得

利用农杆菌介导法将大白菜启动子BcA9与Barnase的融合基因对烟草叶片进行遗传转化,经含Basta的筛选培养基连续筛选,获得了转基因再生植株.转基因植株经PCR扩增,表明BcA9-Barnase基因已整合到烟草基因组中.对转基因植株和野生型植株的花药发育进行细胞学比较观察,显示野生型植株的花药发育正常,花粉粒形态正常,活力高;而转基因植株则发生花药绒毡层细胞提前降解,花粉母细胞退化,成熟花药中无正常花粉粒产生等系列现象.转基因烟草植株最终表现为花药瘦小、自交不能正常结籽等.同时,在高温条件下转基因植株不育性稳定,无育性恢复现象.

BcA9-Barnase转基因雄性不育甘蓝的获得

将白菜绒毡层特异启动子BcA9驱动下的核糖核酸酶Barnase基因,通过农杆菌介导的下胚轴转化导入甘蓝材料‘TF’,获得具有除草剂Basta抗性的甘蓝转基因植株.经PCR鉴定,BcA9-Barnase融合基因已经整合到甘蓝基因组中.细胞学观察显示,转基因甘蓝植株的花药因绒毡层细胞提前降解,花粉母细胞退化,成熟花药中无正常花粉粒产生.相对非转基因对照,转基因甘蓝植株花器官变小,花瓣褶皱多,柱头弯曲,雄蕊瘦小等现象.另外,转基因植株在温度低于22℃时出现明显的死蕾现象,当温度高于25℃时,死蕾现象得到缓解.田间结实情况调查显示,转基因甘蓝植株自交不能结实,与野生型杂交可结实但种荚变短.

Barnase在大肠杆菌中的分泌表达和诱导条件优化

从解淀粉芽孢杆菌中PCR分别扩增解淀粉芽孢杆菌核糖核酸酶barnase基因及其抑制剂barstar基因,采用将barnase基因置于barstar基因保护下的克隆策略,以pET-22b(+)质粒为基础,构建大肠杆菌分泌型表达质粒.IPTG诱导表达目的蛋白后将培养基蛋白进行SDS-PAGE分析并从诱导温度、IPTG诱导浓度和诱导时间三方面初步优化诱导表达条件.

Barnase基因定性PCR检测方法及其标准化

Barnase基因编码核糖核酸酶,在基因工程育种中通常被用于创建雄性不育系。为了满足转barnase基因作物安全监管的需要,建立了barnase基因普通PCR、实时荧光PCR检测方法,具有良好的扩增特异性和检测灵敏度。barnase基因定性PCR检测方法经过了国内8家有资质的实验室的循环验证,结果表明该方法能够特异性检测样品中barnase基因,检测灵敏度均达到0.10%以上,且检测结果具有良好的重复性和重现性。符合标准方法检测特异性强、灵敏度高、重复性好的要求,为我国转barnase基因作物检测和转基因生物安全管理制度的实施提供了相应的技术支撑。

转Bt基因欧洲黑杨转化TA29-Barnase基因的研究

为了获得雄性不育转Bt基因欧洲黑杨,在以叶片为外植体建立转Bt基因欧洲黑杨叶片组培再生体系的基础上,利用农杆菌介导叶盘法将TA29-Barnase基因转化到转Bt基因欧洲黑杨中。结果表明,转Bt基因欧洲黑杨叶片不定芽分化最适培养基为:MS+0.5 mg·L^(-1) 6-BA+0.05mg·L^(-1) NAA+0.01mg·L^(-1) TDZ+30g·L^(-1)蔗糖+6g·L^(-1)琼脂;不定芽生根最适培养基为:1/2MS+0.05mg·L^(-1) NAA+0.2mg·L^(-1) IBA+20g·L^(-1)蔗糖+6g·L^(-1)琼脂;经过在叶片不定芽诱导及生根诱导培养基添加除草剂PPT连续筛选,共获得9株抗性植株。对抗性植株进行基因特异性PCR检测,其中有5株呈阳性,转化阳性率达55.6%。初步表明获得了转Barnase基因的转Bt基因欧洲黑杨植株。

利用AP3-Barnase嵌合基因的表达创制拟南芥雄性不育植株

通过花特异启动子AP3和RNA酶Barnase基因构建了AP3-Barnase雄性不育基因表达盒,并获得了Columbia型转基因拟南芥。通过分子检测、GFP观察和育性分析,结果表明通过花特异启动子AP3调控不育基因Barnase可获得雄性不育植株。表型观察发现对所获得的转基因拟南芥除花器官与野生型对照有差异外,其他表性特征与野生型对照一致。主要差异表现为花瓣缺失、花丝缩短、花药位于柱头约1/3处、花粉活力下降或无活力、角果结实数量稀少甚至不能结实等表型特征。对后代种子的发芽试验结果表明利用AP3启动子驱动Barnase基因可获得雄性不育株,且不影响后代种子的正常发芽过程。该研究结果为雄性不育材料的创制提供了新的基因组合策略和功能参考。

植物杂种优势利用的基因工程研究进展

利用植物杂种优势可以达到植物高产优质的目的。利用杂种优势的途径有人工去雄、化学杀雄、利用植物自交不亲和现象和利用植物雄性不育特性等。然而,这些途径往往费时费力,易造成环境污染,有时对雌性的育性还存在一定影响,等等。 植物基因工程自70年代诞生以来,一直成为令人瞩目的研究领域,一些常规育种方法解决不了的问题,可以通过基因工程方法来解决。迄今为止,不少学者已开展了植物生殖发育的分子生物学研究。

雄性不育基因对棉花的遗传转化

利用TA29、A6、A9三启动子功能区与barnase基因融合构建的不育基因以农杆菌介导法对棉花下胚轴进行了遗传转化,通过胚状体途径获得了转基因再生植株。利用150 mg.L-1高浓度卡那霉素(Km)对转化初期筛选出的再生苗进行再次筛选,提高了转化株的选出率。通过PCR检测和Southern dot blot分析从转基因胚状体再生植株中获得了带有barnase不育基因的120株转基因植株。进行转基因植株生物学性状检测和观察表明,所获得的转基因植株对溴苯腈表现出了明显的抗性,并从不育基因转化植株中筛选出了具有明显不育特征的雄性不育株。

流加培养重组大肠杆菌表达核糖核酸酶Ba

核糖核酸酶Ba(barnase)是一种产自解淀粉芽孢杆菌的胞外核糖核酸酶,具有强毒性,能降解RNA,在农业、医疗、制药等领域有广泛的应用前景.利用重组表达barnase的大肠杆菌为研究对象,以期使用kil基因改善分泌状况,并实现大肠杆菌的高密度培养以及蛋白的高产表达.通过把kil-Km分泌盒克隆入质粒载体pET-32a(+)-barnase-barstar使barnase更加容易分泌与纯化,并使用Riesenberg培养基对重组大肠杆菌发酵生产barnase的不同葡萄糖浓度底物反馈控制补料流加策略进行了研究.初步确定1.0 g/L葡萄糖底物反馈流加时,获得的barnase酶活最高,为7.14 kU/mL,是文献报道的1.88倍,此时细胞干质量浓度为22.93 g/L,其中细胞间质的酶活达到3.53 kU/mL.为今后的发酵bar-nase研究提供了参考.

影响农杆菌介导的大豆基因转化因素的研究

通过农杆菌介导法用含NPT -Ⅱ和Barnase基因导入到大豆幼胚 ,大豆子叶节中 ,然后经过含Kan的筛选培养基中连续筛选 ,获得一批Barnase转基因植株。经PCR扩增结果 ,证实此基因已整合到大豆中 ,在当代植株中生物学特性观察。花粉粒不育率在 98%。

Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells

A kind of cytotoxinic gene barnase was cloned downstream of immediate early promoter from cytomegalovirus (CMV). Recombinant virus vAcCMVBar was constructed using Bac\|to\|Bac system by insertion of the expression cassette into the polyhedrin gene locus of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). Cytotoxinic effect caused by expression of barnase was observed in four mammalian cells after vAcCMVBar infection. Dose\|dependent analysis revealed that one of the cells HICAM was the most sensitive to the virus infection. It was shown that AcNPV could be used as gene transfer vector in mammalian cells and that barnase is the suitable report gene which could be detected more easily than that commonly used.