罂粟BBE基因的生物信息学分析

为了对罂粟BBE基因核酸及编码的蛋白质的性质进行预测分析,并构建罂粟BBE基因的三维结构模型。运用生物信息学方法对罂粟BBE基因的理化性质、亲/疏水性、信号肽、亚细胞定位、二级结构等进行预测,同时采用同源建模的方法对罂粟BBE基因的三维结构进行模拟,并将得到的模型用能量最小化原则优化,最后用Ramachandran Plot对模型进行评估。结果表明:罂粟BBE基因全长为5073 bp,编码一段长为535个氨基酸的蛋白质。BBE为富含Gly、Ser和Leu的酸性稳定类亲水蛋白,定位于液泡中,N-末端含有23个氨基酸的信号肽,α螺旋和无规则卷曲是罂粟BBE的主要二级结构元件。通过同源建模获得了合理的罂粟BBE三维结构模型。本研究为采用生物工程技术提高小檗碱的含量、开发小檗碱类抗菌药物奠定理论基础。

人参皂苷生物合成相关基因PgRg_(2)BBE克隆及生物信息学分析

克隆与人参皂苷Rg_(2)合成相关的重要酶基因PgRg_(2)BBE全长cDNA序列,并利用在线软件对该基因编码的蛋白质进行理化性质、结构域、亚细胞定位和系统进化等分析。结果表明:PgRg_(2)BBE基因cDNA序列长为1638 bp,编码545个氨基酸。PgRg_(2)BBE蛋白分子量为60967.10 u,等电点为8.88,不稳定性指数为34.04,预测该蛋白为一种稳定的亲水性跨膜蛋白,主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。PgRg_(2)BBE蛋白含有FAD_binding_4和BBE功能结构域,定位于叶绿体中,含有24个氨基酸序列信号肽。系统发育树分析发现,其与智利茄的亲缘关系最近,氨基酸序列多重比对发现,RgRg_(2)BBE中含有4个保守基序,进一步与拟南芥AtBBE家族蛋白进行同源序列比对,发现它们同时具有4个保守基序(RKYGL、MGED、FWAIRGG、FPEI)。

罂粟COR和BBE基因RNAi载体构建及烟草转化

本研究通过RNAi技术,使用发卡RNA结构沉默罂粟可待因酮还原酶(COR)与小檗碱桥酶(BBE)基因的表达。采用RT-PCR技术克隆得到COR和BBE基因全序列,同源性比较结果显示,它们与GenBank中已报道的COR和BBE基因高度同源;按照RNAi设计原则,筛选出了COR和BBE基因靶标序列,并采用重叠PCR法将其拼接成643 bp的融合基因,以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pCEPSPS为基础,构建ihpRNA植物表达载体,用农杆菌介导法将目的基因转入烟草中,共获得转基因植株78株,通过PCR检测从中筛选出了17株阳性植株,可初步确定目的基因已经整合到烟草基因组中。

野生罂粟COR、BBE基因片段融合及其RNAi载体构建

可待因酮还原酶(COR)与小檗碱桥酶(BBE)是吗啡合成代谢途径的关键酶,其活性大小直接影响着吗啡合成途径中生物碱的代谢合成。采用RT-PCR从罂粟幼叶克隆出COR和BBE基因全序列,同源性比较结果显示,它们与GenBank上已报道的COR和BBE基因高度同源。利用blast及分子生物学软件DNAStar对COR和BBE基因的cDNA序列同源性进行分析比较,分别从各基因中筛选和克隆了一段同源性极低、约400～500bp的片段;并应用重叠PCR法将其拼接成744bp的融合基因BC,以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,构建了以CaMV35S启动子驱动的含有"正向BC融合片段-pdk内含子-反向BC融合片段"的ihRNAi植物表达载体,通过转化野生罂粟,初步研究了以COR和BBE基因为靶标的RNAi对内源吗啡合成的抑制效果,为进一步培育低吗啡高蒂巴因的罂粟种质提供了依据。