特异扩增BBTV基因组Ⅲ、Ⅳ、Ⅰ编码区部分序列及其在检测中的应用

Banana bunchy top virus disease (BBTD) is a disastrous disease in bananas, and it is spreading in the world (including China) by the banana bunchy top virus(BBTV). At present, virus\|free plantlets are used to prevent BBTD in banana production, therefore, it is very important to establish a method to detect BBTV quickly, sensitively and specifically. ELISA is now popularly used to detect BBTV. The sensitivity of this method is not high enough, and needs specific antiserum, otherwise, pseudo\|positive results often occur. According to DNA coding sequences of component Ⅲ,Ⅳ and Ⅰ of BBTV isolates from Zhangzhou, China, three pairs of primers are designed to establish a PCR method to specifically amplify parts of coding sequences of the BBTV coat protein, movement protein and replicase\|association. This method is also applicable to detect BBTV of bananas or cultured banana seedlings in other regions.

香蕉束顶病毒(BBTV)侵染对寄主内源激素的影响

本试验用ＥＬＩＳＡ方法测定了香蕉感染束顶病毒（ＢＢＴＶ）后植株体内的３种内源激素，赤霉素（ＧＡ３）、玉米素类（ｉＰＡｓ）和脱落酸（ＡＢＡ）的变化。结果表明，感株的ＧＡ３水平在侵染过程中虽有微弱增加，但含量和增长速度显著低于健株对照；ｉＰＡｓ在接种ＢＢＴＶ第１４天后明显下降，并维持较低水平；ＡＢＡ在ＢＢＴＶ侵染后被大量诱导增加并不断积累，在接种后第３５天测定含量最高，为对照的３．３４倍。试验还同时检测了ＢＢＴＶ在侵染过程中的运转。用间接ＥＬＩＳＡ测定的接种叶和顶叶的ＢＢＴＶ含量显示：接种２１天后ＢＢＴＶ在接种叶和顶叶中还大量增殖，呈系统性分布。但寄主的症状在接种３５天后才逐渐在顶叶表现。以上结果表明：香蕉束顶病的症状表现似乎主要与病株中的内源激素的失调有关。

BBTV两个株系DNA组分1的克隆及序列分析

对在生物学特性特别是寄主范围上存在明显差异的 NSP株系和 NS株系的代表分离物 (广州天河分离物和高州分离物 )的 DNA组分 1进行了克隆和序列分析 ,结果表明 :2个代表分离物的DNA组分 1全序列、ORF及其编码的氨基酸序列的变异率分别为 3.2 %、3.1%和 2 .8% ,从而进一步确证了可以用寄主范围来作上述 2个株系的鉴定。此外 ,这 2个株系的 DNA组分 1、ORF及其编码的氨基酸序列分别与肖火根等报道的中国 (广东 )分离物、以及亚洲组和南太平洋组各分离物进行比较 ,结果表明 :NS株系与肖火根等报道的中国 (广东 )分离物的亲缘关系很密切 ;这 2个株系与亚洲组各分离物的差异均较小 ,而与南太平洋组各分离物的差异均较大 。

应用实时荧光定量PCR研究BBTV DNA1在香蕉不同组织中的含量

为准确定量香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)DNA1组分在香蕉组织中的分布和含量,建立以SYBR Green-I荧光染料为标记的实时荧光定量PCR(Real Time Fluorescence Quantitative PCR)方法。利用B1-F/B1-R引物扩增海南BBTV DNA1组分并构建到pMD18T sample载体,再以B2-F/B2-R引物测定该质粒的标准曲线,其线性方程为Y=-3.247×LOG(X)+8.01,相关系数r2=0.997,扩增效率为103.2%,标准质粒检测灵敏度约为214 copies/μL。分别选取染病香蕉的嫩叶、叶鞘、假茎和球茎各100 mg,提取DNA并进行实时荧光定量PCR检测。结果表明:病株各部位均含BBTV病毒,但含量有明显差异,其中嫩叶(3.08×108 copies/mg)>叶鞘(2.50×108 copies/mg)>假茎(1.29×108 copies/mg)>球茎(1.67×107 copies/mg),呈依次递减。

感染BBTV香蕉叶片cDNA文库的构建及评价

为了研究香蕉束顶病毒与香蕉寄主致病的互作分子机制，本文报道利用Make Your Own＂Mate＆Plate＂ Library System试剂盒成功构建感染BBTV香蕉叶片的cDNA文库。通过改良CTAB法提取感染BBTV香蕉叶片的总RNA，采用SMART法反转录合成双链cDNA，经靳，酶切并去除短片段之后，与经同样酶切的pGADT7-SfiI载体连接，利用电转法将重组载体转化到大肠杆菌宿主细胞中，获得初级cDNA文库，最后以初级文库100万克隆为基数扩增，得到扩增文库并提取质粒。结果得到库容量大于2．0X10。的初级文库，检测表明文库cDNA插入片段长度主要分布在700—2000bp，文库重组率为87．5％。结果表明，该文库质量较好，可用于后续酵母双杂交互作蛋白筛选试验，本研究为开展病毒与寄主互作的研究奠定基础。

香蕉束顶病毒(BBTV)的快速提取检测方法

香蕉束顶病毒(Banana Bunchy Top Virus,BBTV)是香蕉上一种危害严重但又难以防治的病毒。目前只能通过及时铲除染病植株来控制传播,因此快速有效的病毒检测技术是防治BBTV的关键。BBTV为单链环状DNA病毒,本试验采用优化后的DNA提取方法提取感病的香蕉样品的DNA,并用特异性引物对提取产物进行PCR检测。结果显示本试验优化的方法操作方便、用时短,并且提取产物能够用于BBTV快速检测,从而为BBTV的快速检测提供新的方法。

香蕉束顶病毒海南分离物DNA2编码区的克隆及抗血清的制备

利用PCR方法克隆香蕉束顶病毒海南分离物(Banana bunchy top virus,BBTV-HN)DNA2编码区,将其插入到原核表达载体pGEX-6p-1谷胱苷肽-S-转移酶(GST)基因下游。所得克隆pGEX-HN-B2测序结果表明,插入的DNA2片段为267bp,且表达相位和理论上设计的完全一致。把此重组质粒转化到E.coli Rosetta(DE3)中,经过异丙硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后出现约33Ku融合蛋白质表达条带。为获得特异的血清,切下目的表达条带并免疫兔子。经Western-blotting检测,获取的血清可以和表达的33Ku融合蛋白特异结合,表明已成功获得DNA2编码蛋白的血清。

香蕉束顶病毒DNA组分2、3的启动子区的组织特异性分析

香蕉束顶病毒（BBTV）基因组至少由6个大小约为1．0～1．1kb的单链环状DNA组分所组成，每一个DNA组分包含编码区与非编码区。在前人的研究基础上进一步了解BBTV DNA组分启动子的功能。首先根据BBTV海南分离物的全序列，通过常规PCR扩增出长为540bp的BBTV DNA3组分启动子序列BV3．1，同时通过重叠PCR扩增出646bp的DNA2与DNA3组分非编码区拼接的重组启动子序列BV23，分别替代pBll21 35S启动子序列与gus基因进行融合，构建植物表达载体pBIBV3．1、pBIBV23。农杆菌介导转化获得的pBIBV3．1转基因烟草经GUS化学组织染色后，在其叶片的叶脉处检测到微弱的GUS活性，证实了DNA3组分的韧皮部特异表达活性；而pBIBV23转基因烟草，其叶片经GUS组织化学染色后，在叶肉、叶缘及一些叶脉上检测到弱GUS活性，这表明由BV23驱动的gus基因在烟草中类似于组成型表达，则DNA2组分转录方式可能有异于DNA3组分。

香蕉束顶病毒株系生物学特性的研究

在广东香蕉束顶病株症状基本相同的情况下 ,在 8个产区分别随机采集 11～ 15个标样共 111个分离物 ,接种在香蕉苗上 ,其后又从 8个产区的分离物中各选取 1个代表分离物用于进行各项研究。寄主范围试验结果 ,这 8个代表分离物可分为能侵染粉蕉的 NSP株系 (以广州天河分离物为代表的 7个分离物 )和不能侵染粉蕉的 NS株系 (高州代表分离物 )。用 Eco RI对 8个毒源地的 111个分离物 DNA组分 1进行酶切分析 ,结果表明 :所有高州分离物共 15个和信宜分离物 14个中的 9个都可以被酶切 ,应属 NS株系 ;而其余 6个毒源地的所有分离物及信宜分离物中的另外 5个都不能被酶切 ,应属 NSP株系。在病害潜育期方面 ,2个株系在大蕉上的差异达到显著水平 ;在香蕉 4个品种上 ,2株系也存在较明显的差异 ,但其中有些差异未达到显著水平。在病毒增殖、运转速度及病毒达到高浓度所需的时间上 ,2个株系也存在显著的差异。

香蕉两种主要病毒多重PCR检测方法的建立

根据香蕉束顶病（Banana bunchy top virus，BBTV）和香蕉花叶心腐病（Cucumber mosaic virus，CMV）的复制酶基因、外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物对，在BBTV单一PCR和CMV RT-PCR优化体系的基础上，建立了可同时检测BBTV、CMV的多重PCR检测方法。此方法可以特异地从感染BBTV和CMV的样品中扩增出2条带，BBTV（748bp）和CMV（557bp）。扩增产物序列测定结果表明，BBTV扩增产物与GenBank中其他分离物的核苷酸序列同源性为91％～99％，CMV扩增产物与GenBank中其他分离物的核苷酸序列同源性为93％～98％。

香蕉束顶病毒DNA组分6的克隆和序列分析

The DNA component 6 of a Chinese isolate of banana bunchy top virus (BBTV) was cloned and sequenced. It is 1,081 nucleotides in length. Between the component sequences of Chinese and Australian BBTV isolates, there are 85.5% nucleotide sequence identity in full length, 92.5% nucleotide sequence identity in predicted open reading frame (ORF) and 94.8% amino acid sequence identity of potentially encoded proteins. The DNA component 6 is present in all BBTV infections tested, so it may have special function in transmission, infection, replication or movement of BBTV.

香蕉束顶病毒海口分离物核穿梭蛋白(NSP)的纯化及抗血清制备

本研究以本实验室保存的含重组载体pDEST17-NSP的原核表达菌株E.coli BL21(DE3)为材料,于25℃、0.1mmol/L IPTG条件下诱导4h,集菌后超声波破碎,获得以包涵体形式表达的约20kD的融合蛋白。实验结果表明,将沉淀的融合蛋白溶于含6mol/L尿素的Binding Buffer中,再经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,可获得高纯度的融合蛋白。将纯化融合蛋白经12%SDS-PAGE电泳,切胶回收目的带,液氮研磨并按1:1(W/V)混合佐剂,4次免疫家兔,获得BBTV病毒核穿梭蛋白的特异性抗血清。以融合蛋白作抗原,间接ELISA法测定其抗血清效价为1:5000。田间检测样品的最佳抗血清工作浓度为1:500。Western Blot鉴定结果表明抗血清能与目的蛋白特异性结合。本研究的结果将为下一步NSP基因转录调控和蛋白功能研究奠定一定基础。

香蕉束顶病毒基因组I的克隆及序列分析

以中国漳州地区感染BBTV的香蕉组织总DNA为模板 ,根据我国台湾地区BBTV分离物基因组I序列 ,设计并合成了一对引物 ,通过PCR扩增出约 5 0 0bp的片段。利用pBluescriptⅡSKT -载体获得此片段的克隆 ,经测序表明为BBTV组分Ⅰ的部分序列。由已测知的BBTV基因组Ⅰ序列设计一对相邻引物 ,以我国漳州的感染BBTV香蕉组织总DNA为模板 ,通过PCR扩增出约 1.1kb的片段。利用pBluescriptⅡSKT -载体获得 1.1kb片段的克隆。测序结果表明漳州BBTV基因组Ⅰ含有 110 4个核苷酸 ,其序列与澳大利亚及我国台湾地区的BBTV基因组Ⅰ核苷酸同源性分别为 89%、96 % ,并对此序列的功能进行了推测及讨论。

香蕉束顶病毒NS株系DNA组分6的克隆及序列分析

通过常规的基因克隆技术 ,对香蕉束顶病毒NS株系代表分离物的DNA组分 6进行了克隆和序列分析 ,并将该分离物这个组分的序列与先前报道的广州天河分离物 (属NSP株系 )的该组分序列进行比较 ,结果表明 :该组分全序列、ORF及其编码的氨基酸序列在 2个分离物间的变异率分别为 3 4%、1 7%和 2 6 % .表明该组分在 2个株系代表分离物间存在较显著差异 ,从而进一步支持了广东BBTV存在 2个株系的结论 .此外 ,NS株系代表分离物DNA组分 6的全序列、ORF及其编码的氨基酸序列与澳大利亚分离物的变异率分别为 14.4%、7.5 %和 7.1% .

香蕉束顶病毒的提纯和血清学研究

以香蕉交脉蚜（Ｐｅｎｔａｌｏｎｉａｎｉｇｒｏｎｃｒｖｏｓａ）人工接种表现典型束顶病症状的香蕉组培苗为材料，预预先经氯仿－正丁醇充分乳化的缓冲液抽提和澄清、差速离心、蔗糖垫部分纯化、蔗糖梯度离心，得到粒体完整的直径约１８－２０ｎｍ的球状病毒。提纯的病毒制剂具典型的核蛋白紫外吸收光谱，最高吸收峰在２５７ｎｍ左右，最低吸收峰在２４０ｎｍ左右，Ａ２６０／２８０＝１．３，提纯产量最高可达３．４ｍｇ／ｋｇ组织。用上述提纯病毒作为抗原免疫家兔制备的抗血清，经对流免疫电泳方法测定效价为１：３２。用该抗血清建立的Ａ蛋白夹心ＥＬＩＳＡ（ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ）及与单克隆抗体结合使用的异种抗体双夹心ＥＬＩＳＡ（ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ）能检测各种香蕉束顶病样品。

香蕉束顶病毒Rep蛋白特性分析及纯化体系的建立

以香蕉束顶病毒海口分离物DNA1(Accession NO.FJ463042)的Rep蛋白为研究对象,利用生物信息学软件对该蛋白的理化性质、结构组成、信号肽、磷酸化、二级结构、三级结构与功能结构域等作了较为详细的分析与预测,并配置了相关纯化试剂。将含重组质粒pET32b-Rep的E.coli BL21(DE3),接种到LB液体培养基,在20℃、0.1 mmol/L IPTG条件诱导4 h,产生大量的可溶性重组蛋白,经AKTA Explorer100系统亲和层析柱后,用不同梯度的Washing buffer洗脱杂蛋白并对各阶段产物进行12%SDS-PAGE分析,确定了100mmol/L咪唑的Washing buffer洗脱浓度,最终获得大量高纯度的重组蛋白。以His*Tag Monoclonal Antibody为一抗,Western blot鉴定结果表明纯化重组蛋白即为His-Rep融合蛋白。该纯化体系的建立为研究BBTVRep蛋白的结晶奠定了基础,也为今后ABTV、FBNYV、MVDV、PNYDV等病毒的相关复制蛋白纯化提供了重要数据。

香蕉束顶病毒Haikou2分离物DNA2编码框原核表达及抗血清制备

香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)是危害香蕉的主要病毒之一,严重威胁着香蕉的生产。BBTV基因组至少由6个环状ssDNA组分组成,其中DNA2组分变异最大,是否编码蛋白及其功能缺乏研究。本研究通过PCR方法克隆了BBTV Haikou2 DNA2 ORF,将其构建到pET32a载体中,进行原核表达和抗血清制备。结果表明重组表达载体pET32a-DNA2ORF在表达菌Transetta(DE3)中表达一个约21 ku的特异融合蛋白,通过超声波破碎仪破碎细胞和诱导条件优化,分析表明,该蛋白主要以可溶形式存在,最佳表达条件为30℃、1.0 mmol/L IPTG诱导3 h。融合蛋白经过Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化,免疫家兔制备出抗血清。Western blot实验表明抗血清具有特异性;酶联法(ID-ELISA)测定表明,抗血清效价达到25 000,能够检测出香蕉汁液中加入的0.954μg/mL浓度的表达纯化蛋白。

香蕉束顶病毒基因附加组分的克隆及序列分析

采用PCR的方法分别克隆了香蕉束顶病毒(BBTV)广东分离物NS株系和NSP株系的附加组分,将之命名为BT-NS和BT-NSP。序列分析发现,2个附加组分基因全长均为1 094 nt,其核苷酸的同源率为97.3%,编码氨基酸的同源率为98.4%;与BBTV台湾分离物附加组分S1、S2和越南分离物附加组分S3相比,BT-NS/NSP与S1的氨基酸序列相似率最高,与S2的相似率最低。每一附加组分的ORF均含有推导的与脱氧核苷酸结合的基序,具有潜在的复制酶活性。通过对BBTV编码复制酶基因组分的进化树分析发现,BT-NS/NSP与BBTV台湾附加组分S1的亲缘关系最近,与广东分离物NSP株系DNA组分1的亲缘关系较远。