Cloning of Banana Bunchy Top Virus Chinese Zhangzhou Isolate DNA 4 and the Promoter Activity of Its Non_coding Region

Banana bunchy top virus Chinese Zhangzhou isolate (BBTV-ZZ) DNA 4 was amplified by PCR and cloned. Sequence analysis showed that BBTV-ZZ DNA 4 is 1 039 nucleotides (nts) in length and this virus could be one member of BBTV Asian group. Transcriptional initiation site A, which is at the 269 nucleotide, was preliminarily determined by using 5' RACE method. BBTV-ZZ DNA 4 non-coding region was sub-cloned by PCR and inserted into upstream of gfp : : gus plant expression vector pCAMBIA 1304 to construct recombinant plasmid pTA2. Agrobacterium tumefaciens harboring pTA2 was injected into leaves of the tobacco (Nicotiana tabacum L. cv. Xanthi NC) via Agrobacterium-infiltration procedure. Transient expressions of GUS and GFP were determined in injected leaves 3 - 5 d later. GUS activities of pTA2, pCAMBIA 1304 injected and non-injected tobacco leaves respectively were 1.007 0 pmol MU(.)mug(-1.)min(-1), 2.069 0 pmol MU(.)mug(-1.)min(-1) and 0.021 4 pmol MU(.)mug(-1.)min(-1). Indirect ELISA for GFP in 1 mg total protein from pTA2, pCAMBIA 1304 injected and non-injected leaves showed an A(490 nm) value of 89.577, 100.440 and 3.287, respectively. These results showed that the non-coding region of BBTV-ZZ DNA 4 has a promoter activity not only in the virus replication in monocot, but also in driving the expression of a foreign gene in dicot plants.

Occurrence and Distribution of <i>Banana bunchy top virus</i>Related Agro-Ecosystem in South Western, Democratic Republic of Congo

Banana bunchy top virus (BBTV) is one of the most severe and widespread virus limiting production and distribution of planting material of banana (Musa spp.) crops in the world. In Democratic Republic of Congo (DRC), these crops play a major role in daily life of almost 70% of citizen. Many factors influence banana production negatively such as Banana bunchy top disease. Epidemiological survey was conducted in experimental stations and farmers’ fields for two consecutive seasons covering 72 sites in five provinces of south western of RDC. The objective of this study was to evaluate the presence and distribution of the Banana bunchy top virus in five provinces of South Western of DRC, with emphasis on the agro-ecological factors. A total of 174 Musa spp. leaves samples were collected and analyzed by PCR. The results revealed the presence of BBTV in all provinces investigated. The frequency of BBTV was 6.3% in Bandundu, 12.1% in Kasa?Oriental, 17.8% Bas Congo, 1.1% in Katanga and 7.5% Kinshasa Urban and Peri-urban. Results also revealed that BBTV occurred in experimental station and farmers’ fields, both having all cooking and dessert bananas. The high prevalence of BBTV seemed to be linked to multiple introductions of planting materials in the Bas Congo province during 1990 and 2002. However, the province of Katanga had not experienced the introduction of planting material. This factor would explain the lowest prevalence of Banana bunchy top virus in this province. The results indicated that there was a real need to facilitate access to genetically improved and healthy certified planting material in these provinces.

Studies on the cloning genomec5 of BBTV in Guangzhou areas and its expression in transgenic banana

The DNA was isolated from banana bunchy top virus （BBTV） in Guangzhou areas and a l.lkb DNA of replicas of BBTV was obtained by PCR using this virus DNA as templates for amplification. This reformed DNA of the BBTV replicas which being homologous to 90% with the Australia＇s encoded the C-Terminal of BBTV replicas. The reformed BBTV replicas were cloned to pBI121 in the position between CaMV 35S promoter and NOS termination sequence, and a plant-expressed carder was established. Four transgenic bananas with the expression of BBTV replicase gene in To generation were detected with PCR and Western blot analysis. The ability of these transgenic bananas against bunchy top virus is being analyzed.

香蕉束顶病毒(BBTV)侵染对寄主内源激素的影响

本试验用ＥＬＩＳＡ方法测定了香蕉感染束顶病毒（ＢＢＴＶ）后植株体内的３种内源激素，赤霉素（ＧＡ３）、玉米素类（ｉＰＡｓ）和脱落酸（ＡＢＡ）的变化。结果表明，感株的ＧＡ３水平在侵染过程中虽有微弱增加，但含量和增长速度显著低于健株对照；ｉＰＡｓ在接种ＢＢＴＶ第１４天后明显下降，并维持较低水平；ＡＢＡ在ＢＢＴＶ侵染后被大量诱导增加并不断积累，在接种后第３５天测定含量最高，为对照的３．３４倍。试验还同时检测了ＢＢＴＶ在侵染过程中的运转。用间接ＥＬＩＳＡ测定的接种叶和顶叶的ＢＢＴＶ含量显示：接种２１天后ＢＢＴＶ在接种叶和顶叶中还大量增殖，呈系统性分布。但寄主的症状在接种３５天后才逐渐在顶叶表现。以上结果表明：香蕉束顶病的症状表现似乎主要与病株中的内源激素的失调有关。

BBTV两个株系DNA组分1的克隆及序列分析

对在生物学特性特别是寄主范围上存在明显差异的 NSP株系和 NS株系的代表分离物 (广州天河分离物和高州分离物 )的 DNA组分 1进行了克隆和序列分析 ,结果表明 :2个代表分离物的DNA组分 1全序列、ORF及其编码的氨基酸序列的变异率分别为 3.2 %、3.1%和 2 .8% ,从而进一步确证了可以用寄主范围来作上述 2个株系的鉴定。此外 ,这 2个株系的 DNA组分 1、ORF及其编码的氨基酸序列分别与肖火根等报道的中国 (广东 )分离物、以及亚洲组和南太平洋组各分离物进行比较 ,结果表明 :NS株系与肖火根等报道的中国 (广东 )分离物的亲缘关系很密切 ;这 2个株系与亚洲组各分离物的差异均较小 ,而与南太平洋组各分离物的差异均较大 。

香蕉分化芽BBTVDAS-ELISA检测方法的建立和应用

为了解海南海口香蕉分化芽携带香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)的情况,本研究建立了双抗夹心酶联免疫反应(DAS-ELISA)检测法,对来自海南地区组培厂的香蕉分化芽进行检测。检测结果表明,6个品种1 852个香蕉分化芽平均带毒率为2.1%,其中‘皇帝蕉’为1.98%,‘粤科1号’为2.07%,‘广粉蕉’为1.98%,‘大蕉’为6.25%,‘218’为1.89%,‘巴西蕉’为2.25%。为了进一步验证ELISA结果的可靠性,随机选取12个阳性样品提取总DNA进行PCR鉴定。鉴定结果显示,12个样品中11个检测出有BBTV,表明DAS-ELISA方法的准确率较高,与分子检测结果基本一致,可以胜任日常香蕉组培苗BBTV的检测。

香蕉束顶病毒(BBTV)的快速提取检测方法

香蕉束顶病毒(Banana Bunchy Top Virus,BBTV)是香蕉上一种危害严重但又难以防治的病毒。目前只能通过及时铲除染病植株来控制传播,因此快速有效的病毒检测技术是防治BBTV的关键。BBTV为单链环状DNA病毒,本试验采用优化后的DNA提取方法提取感病的香蕉样品的DNA,并用特异性引物对提取产物进行PCR检测。结果显示本试验优化的方法操作方便、用时短,并且提取产物能够用于BBTV快速检测,从而为BBTV的快速检测提供新的方法。

Bioinformatic Analysis of BBTV Satellite DNA in Hainan

Banana bunchy top virus (BBTV),family Nanaviridae,genus Babuvirus,is a single stranded DNA virus (ssDNA) that causes banana bunchy top disease (BBTD) in banana plants.It is the most common and most destructive of all viruses in these plants and is widespread throughout the Asia-Pacific region.In this study we isolated,cloned and sequenced a BBTV sample from Hainan Island,China.The results from sequencing and bioinformatics analysis indicate this isolate represents a satellite DNA component with 12 DNA sequences motifs.We also predicted the physical and chemical properties,structure,signal peptide,phosphorylation,secondary structure,tertiary structure and functional domains of its encoding protein,and compare them with the corresponding quantities in the replication initiation protein of BBTV DNA1.

香蕉束顶病毒株系生物学特性的研究

在广东香蕉束顶病株症状基本相同的情况下 ,在 8个产区分别随机采集 11～ 15个标样共 111个分离物 ,接种在香蕉苗上 ,其后又从 8个产区的分离物中各选取 1个代表分离物用于进行各项研究。寄主范围试验结果 ,这 8个代表分离物可分为能侵染粉蕉的 NSP株系 (以广州天河分离物为代表的 7个分离物 )和不能侵染粉蕉的 NS株系 (高州代表分离物 )。用 Eco RI对 8个毒源地的 111个分离物 DNA组分 1进行酶切分析 ,结果表明 :所有高州分离物共 15个和信宜分离物 14个中的 9个都可以被酶切 ,应属 NS株系 ;而其余 6个毒源地的所有分离物及信宜分离物中的另外 5个都不能被酶切 ,应属 NSP株系。在病害潜育期方面 ,2个株系在大蕉上的差异达到显著水平 ;在香蕉 4个品种上 ,2株系也存在较明显的差异 ,但其中有些差异未达到显著水平。在病毒增殖、运转速度及病毒达到高浓度所需的时间上 ,2个株系也存在显著的差异。

香蕉两种主要病毒多重PCR检测方法的建立

根据香蕉束顶病（Banana bunchy top virus，BBTV）和香蕉花叶心腐病（Cucumber mosaic virus，CMV）的复制酶基因、外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物对，在BBTV单一PCR和CMV RT-PCR优化体系的基础上，建立了可同时检测BBTV、CMV的多重PCR检测方法。此方法可以特异地从感染BBTV和CMV的样品中扩增出2条带，BBTV（748bp）和CMV（557bp）。扩增产物序列测定结果表明，BBTV扩增产物与GenBank中其他分离物的核苷酸序列同源性为91％～99％，CMV扩增产物与GenBank中其他分离物的核苷酸序列同源性为93％～98％。

利用超低温保存方法脱除香蕉束顶病毒的研究

香蕉束顶病毒(BBTV)是香蕉生产中的严重病害之一,主要通过感病材料和香蕉交脉蚜等昆虫进行传播,目前尚无有效防治方法。本研究以感染BBTV的巴西蕉(MusaAAA Cavendish)为材料,研究了感染BBTV的巴西蕉离体再生和超低温保存技术条件,表明离体茎尖在MS+6-BA4.0 mg/L+NAA0.4 mg/L的培养基上分化不定芽较好;采用玻璃化法超低温保存技术保存带有BBTV的香蕉茎尖,再生后植株BBTV脱除率达到60.6%,而常规的茎尖培养对BBTV的脱除率仅为26.7%。

香蕉束顶病毒单克隆抗体的制备及其应用

用纯化的香蕉束顶病毒(BBTV)抗原免疫BALB/C小鼠。取脾脏细胞与骨髓瘤NS-1细胞融合。经HAT培养液选择性培养,间接ELISA方法筛选阳性孔。阳性杂交瘤用有限稀释法克隆,间接ELISA法复筛,最后获得201E_3、302C_4两株稳定分泌抗BBTV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。其免疫球蛋白亚类为IgM。纯化后的腹水抗体,用间接ELISA和斑点法(DIA)检测了采自云南河口、个旧和澳大利亚的BBTV病样样品,表现出特异性反应。最高效价达1:64000,培养上清液效价为1:16。经3个月连续培养,仍能稳定分泌抗BBTV McAb.结果表明,已建立了稳定分泌抗香蕉束顶病毒特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株。制备的McAb能应用于香蕉束顶病的诊断和病毒的研究。

香蕉束顶病毒DNA组分6的克隆和序列分析

The DNA component 6 of a Chinese isolate of banana bunchy top virus (BBTV) was cloned and sequenced. It is 1,081 nucleotides in length. Between the component sequences of Chinese and Australian BBTV isolates, there are 85.5% nucleotide sequence identity in full length, 92.5% nucleotide sequence identity in predicted open reading frame (ORF) and 94.8% amino acid sequence identity of potentially encoded proteins. The DNA component 6 is present in all BBTV infections tested, so it may have special function in transmission, infection, replication or movement of BBTV.

香蕉束顶病毒的纯化及理化特性

从具有典型香蕉束顶病(BBTD)症状的香蕉病组织中提纯了香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)。电镜下可观察到直径为18nm的球形病毒颗粒。最高紫外吸收在255nm,最低紫外吸收在240nm,A_(260)/A_(280)为1.30。用标准BBTV抗体通过ECL-Western转印法测定其外壳蛋白分子量为21kDa。其核酸经DNaseI、RNaseA和Mung Bean Nuclease分析,表明是约1kb的ssDNA。结果与国外文献报道一致。

工厂化组培香蕉分化芽中病毒的检测

采用间接ELISA法和PCR方法对组织培养的香蕉分化芽中黄瓜花叶病毒(CMV)、香蕉线条病毒(BSV)和香蕉束顶病毒(BBTV)分别进行了检测,用间接ELISA法抽检香蕉分化芽中的CMV,带毒率为2 5%左右;PCR法检测香蕉分化芽中BSV和BBTV,40个送检样品中带BSV的为12 5%,22个送检样品中未检测到带BBTV的香蕉分化芽.

香蕉束顶病毒株系的研究

采自福建各地蕉区的不同香蕉束顶病毒株类型之间致病性和介体蚜虫的传病率有明显的差异，进一步依其在香蕉品种台湾蕉和Ｗｉｌｉａｍｓ上的反应、香蕉交脉蚜的传病率、毒株类型之间的交互保护和血清学测定结果等，把香蕉束顶病毒区分为ＢＢＴＶ－Ｓ（重型）和ＢＢＴＶ－Ｍ（轻型）两个株系。ＢＢＴＶ－Ｍ和ＢＢＴＶ－Ｓ均能引致香蕉叶片上的青筋症状，两者在血清学上有密切关系，但ＢＢＴＶ－Ｍ仅引致植株产生少量青筋，而ＢＢＴＶ－Ｓ除引致香蕉植株上有大量青筋之外，还引致严重矮化、束顶以及轻度黄化，ＢＢＴＶ－Ｍ的潜育期较ＢＢＴＶ－Ｓ明显长，香蕉交脉蚜对ＢＢＴＶ－Ｓ的传病率大大高于对ＢＢＴＶ－Ｍ的传病率。

香蕉束顶病毒海口分离物Rep基因的克隆、原核表达、抗血清制备及检测

[目的]对香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)海口分离物起始蛋白(replication initiation pro-teins,Rep)基因进行克隆、原核表达、抗血清制备,为BBTV有效的检测及分子流行病学等研究奠定基础。[方法]以海口地区染病香蕉幼嫩假茎和叶片的总DNA为模板,通过PCR技术克隆BBTV海口分离物的起始蛋白基因,连接到表达载体并进行大肠杆菌原核表达,制备高效价特异性抗血清。[结果]应用PCR方法从染毒香蕉幼嫩假茎和叶片总DNA中扩增复制rep基因,回收目的片段后经酶切,获得了含BBTV Rep基因的重组质粒pET32b-Rep。将重组质粒转化E.coliBL21(DE3),经不同的时间、温度及IPTG浓度优化,12%SDS-PAGE电泳分析,在20℃、0.1 mmol/L IPTG条件诱导4h,最终获得大量的可溶性融合蛋白。将可溶性蛋白上清液经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化,得到高纯度的融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫家兔,获得了BBTV Rep蛋白抗血清。以融合蛋白做抗原,间接ELISA法测定抗血清效价大于125 000。以田间样品做抗原时,结果表明抗血清最佳工作浓度为1∶1 000。Western blot鉴定结果表明抗血清能与融合蛋白特异性结合。[结论]利用Rep基因制备的特异性抗血清在BBTV病毒粒体的组装机制研究及病毒病诊断上具有重要的应用价值。

香蕉束顶病流行学及综合防治技术研究

云南在50年代后期从越南、广东等地引进香蕉种苗后发生香蕉束顶病,至今由于大量从外省调入种苗已有三次大流行.现有香蕉栽培品种都感病.蕉园病株率平均每10天增加2.07%,5～7月为高峰期,三年后病害增长显著.病害流行与交脉好的发生有密切关系.本文报道了“区域防治、销毁病株、无病种苗、适时防蚜”的综合防治技术及具体实施方法.应用该技术在红河县500亩香蕉基地上示范,取得明显的防治效果和经济效益.

香蕉束顶病毒海口分离物核穿梭蛋白(NSP)的纯化及抗血清制备

本研究以本实验室保存的含重组载体pDEST17-NSP的原核表达菌株E.coli BL21(DE3)为材料,于25℃、0.1mmol/L IPTG条件下诱导4h,集菌后超声波破碎,获得以包涵体形式表达的约20kD的融合蛋白。实验结果表明,将沉淀的融合蛋白溶于含6mol/L尿素的Binding Buffer中,再经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,可获得高纯度的融合蛋白。将纯化融合蛋白经12%SDS-PAGE电泳,切胶回收目的带,液氮研磨并按1:1(W/V)混合佐剂,4次免疫家兔,获得BBTV病毒核穿梭蛋白的特异性抗血清。以融合蛋白作抗原,间接ELISA法测定其抗血清效价为1:5000。田间检测样品的最佳抗血清工作浓度为1:500。Western Blot鉴定结果表明抗血清能与目的蛋白特异性结合。本研究的结果将为下一步NSP基因转录调控和蛋白功能研究奠定一定基础。

香蕉束顶病毒基因组I的克隆及序列分析

以中国漳州地区感染BBTV的香蕉组织总DNA为模板 ,根据我国台湾地区BBTV分离物基因组I序列 ,设计并合成了一对引物 ,通过PCR扩增出约 5 0 0bp的片段。利用pBluescriptⅡSKT -载体获得此片段的克隆 ,经测序表明为BBTV组分Ⅰ的部分序列。由已测知的BBTV基因组Ⅰ序列设计一对相邻引物 ,以我国漳州的感染BBTV香蕉组织总DNA为模板 ,通过PCR扩增出约 1.1kb的片段。利用pBluescriptⅡSKT -载体获得 1.1kb片段的克隆。测序结果表明漳州BBTV基因组Ⅰ含有 110 4个核苷酸 ,其序列与澳大利亚及我国台湾地区的BBTV基因组Ⅰ核苷酸同源性分别为 89%、96 % ,并对此序列的功能进行了推测及讨论。