大豆BBi基因ihpRNA种子特异性表达载体的构建

【目的】构建具有大豆蛋白酶抑制剂BBi基因反向重复结构的ihpRNA种子特异性表达载体,并将其转入根癌农杆菌中,为大豆品质改良奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆大豆蛋白酶抑制剂BBi基因的正义和反义片段、大豆种子特异性启动子7αP和作为内含子的GFP基因片段,分别连入克隆载体pMD18-T Vector中。然后根据植物中ihpRNA原理,以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,将组成RNAi载体的4个目的片段分别连入其中,然后利用冻融法转化根癌农杆菌,并进行PCR鉴定。【结果】PCR扩增得到组成RNAi载体的4个目的片段,分别构建成重组克隆载体和ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-GFP-BBiS,并转化得到含有p7αP-GFP-BBiS的农杆菌EHA101和EHA105。【结论】成功构建了具有BBi基因反向重复结构的ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-GFP-BBiS,BBi基因的ihpRNA表达框架成功转入到农杆菌中。

大豆KTi基因和BBi基因双价RNAi表达载体的构建

以KTi基因的ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-GUS-KTiS为模板,采用PCR技术克隆含有KTi基因的完整ihpRNA构件,并将其克隆到pMD18-T载体,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并进行序列比对;然后以BBi基因ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-GFP-BBiS为基础,利用限制性内切酶BstⅪ单酶切,将KTi基因的完整ihpRNA构件连入其中。最后利用冻融法转化根癌农杆菌,并进行PCR鉴定。结果表明:PCR扩增得到含有KTi基因的完整ihpRNA构件,构建成重组克隆载体pMD18-T-KRNAi,并构建成双价ihpRNA种子特异性表达载体pKTi-BBi-RNAi,并转化得到含有pKTi-BBi-RNAi的农杆菌EHA105。成功构建同时具有大豆胰蛋白酶抑制剂KTi基因和BBi基因的双价RNAi种子特异性表达载体,KTi基因和BBi基因的ihpRNA表达框架成功转入农杆菌中。