BCG-CpG-DNA佐剂人用狂犬病疫苗(MRC-5细胞)在食蟹猴体内的免疫原性

目的 评价BCG-CpG-DNA佐剂人用狂犬病疫苗(MRC-5细胞)在食蟹猴体内的免疫原性。方法 将食蟹猴随机分为对照组、3针组及4针组,经后肢肌肉免疫,1.0 mL/剂。3针组及4针组均接种BCG-CpG-DNA佐剂人用狂犬病疫苗,3针组于0 d、7 d、21 d各接种1剂,4针组于0 d、3 d、7 d、14 d各接种1剂;对照组接种市售国产同类疫苗,于0 d注射2剂、7 d及21 d各1剂。初免前(0 d)及初免后7 d、14 d、28 d、35 d、49 d、63 d后肢隐静脉采血,分离血清及外周血淋巴细胞。快速荧光灶抑制实验(Rapid Fluorescent focus Inhibition Test, RFFIT)及酶联免疫斑点检测技术(Enzyme-linked Immunospot Assay, ELISPOT)分别检测血清中抗狂犬病病毒中和抗体水平和外周血淋巴细胞中细胞因子IFN-γ、IL-2的表达水平。结果 食蟹猴血清中和抗体水平于免疫前均呈阴性(抗体效价<0.5 IU/mL),3针组和对照组在初免后7~28 d呈上升趋势,于28 d达最高,4针组在14 d达最高;在初免后28 d,对照组、3针组中和抗体水平显著高于4针组;初免后35 d,3针组中和抗体水平显著高于4针组,其余时间点同时间各组间差异均无统计学意义(P均>0.05)。3针组及4针组外周血淋巴细胞中IL-2及IFN-γ水平在7~14 d呈上升趋势,于14 d达最高,且3针组IFN-γ水平显著高于对照组,其余时间点同时间各组间差异均无统计学意义。结论 BCG-CpG-DNA佐剂人用狂犬病疫苗(MRC-5细胞)具有良好的免疫原性,具有优化狂犬病免疫接种程序的应用价值。

BCG-CpG-DNA免疫活性作用的初步研究

目的研究BCG-CpG-DNA的免疫学活性。方法通过淋巴细胞增殖、T细胞亚群分析、细胞因子产生、对NK细胞杀伤功能影响等试验,检测BCG-CpG-DNA的免疫活性。结果BCG-CpG-DNA能促进小鼠T、B淋巴细胞增殖,活化巨噬细胞分泌IL-12,并能增强ConA诱导IFN-γ产生,提高小鼠脾细胞中CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群的含量,同时增强小鼠NK细胞的杀伤活性。实验组与对照组所有结果差异均有显著意义(P<0.05)。结论BCG-CpG-DNA能活化抗原呈递细胞(APC),并具有较好的免疫活性。

BCG-CpG-DNA制备、理化特性及免疫刺激活性的初步研究

采用机械破碎、CTAB沉淀、酚:氯仿:异戊醇抽提法从卡介菌(BCG)中制备BCG-CpG-DNA,经化学方法确定其理化成分,通过双抗体夹心ELISA法检测小鼠IgM水平检测其免疫刺激活性.结果显示每克半干重的卡介菌提取BCG-CpG-DNA约0.9mg.提取物主要成分为BCG-CpG-DNA,分子量大小在3 000～15 710 bp,含少量的多糖和蛋白;紫外分光扫描在260nm有最大吸收;对特异性识别DNA长链的CCGG中的CpG位点的限制性内切酶HpaⅡ高度敏感;能够活化小鼠B细胞产生IgM.所制备的BCG-CpG-DNA含较多的未甲基化CpG基序,具有免疫刺激活性功能.

BCG-CpG-DNA对A群脑膜炎球菌多糖疫苗的免疫佐剂作用

目的探讨免疫佐剂BCG-CpG-DNA对A群脑膜炎球菌多糖疫苗的作用。方法将不同剂量(5、10、100μg)的免疫佐剂BCG-CpG-DNA与A群脑膜炎球菌多糖疫苗直接混合后,皮下免疫小鼠,与未添加佐剂疫苗比较,ELISA法检测抗原特异性IgG抗体水平,并分析抗体亚类IgG1和IgG2a的水平。结果BCG-CpG-DNA能提高A群脑膜炎球菌多糖疫苗特异性抗体IgG水平,并能促进抗原特异性抗体亚类的产生,其中佐剂中、高剂量(10、100μg)实验组IgG、IgG2a水平与未加入免疫佐剂疫苗之间差异有统计学意义。结论BCG-CpG-DNA对A群脑膜炎球菌多糖疫苗有免疫佐剂作用。

BCG-CpG-DNA对重组HBsAg免疫原性的影响

为了研究BCG-CpG-DNA对重组HBsAg免疫原性的影响,了解其佐剂功能。采用不同剂量BCG-CpG-DNA与不同剂量重组(汉逊酵母)表达的HBsAg或Al-HBsAg混合免疫小鼠,与同剂量铝佐剂疫苗对比,以放射免疫法检测抗-HBs中和抗体水平和抗体持续时间,ELISA法检测抗体亚类。结果显示,BCG-CpG-DNA和HBsAg混合,抗-HBs的中和抗体水平达到或高于同剂量铝佐剂疫苗;BCG-CpG-DNA和Al-HBsAg混合,抗-HBs的中和抗体水平高于同剂量铝佐剂疫苗,并有统计学显著意义(P<0.05);添加BCG-CpG-DNA组抗体水平4周时增加不明显,到10周则显著地高于同剂量铝佐剂疫苗组,IgG2a抗体水平也高于相应的对照组。实验结果表明BCG-CpG-DNA对HBsAg有较好的免疫佐剂作用,并和AL佐剂有协同作用。

BCG-CpG-DNA重复给药对家兔的安全性评价

目的观察BCG-CpG-DNA对家兔的毒性作用,进行安全性评价。方法用BCG-CpG-DNA 100、250、500μg在28d内分7次对家兔进行肌肉免疫,大腿股四头肌局部刺激,对照组注射等量生理盐水。观察每次注射后注射局部变化情况,末次免疫后2d检测血液学、血液生化学指标及主要脏器系数,观察注射局部肌肉刺激情况,并取注射部位肌肉和主要免疫器官做病理学检查。结果 BCG-CpG-DNA重复给药后肉眼观察对注射部位皮肤和肌肉无明显刺激作用;血液学结果显示可提高免疫细胞的数量,对血液学其他指标、血液生化学指标和脏器系数无明显的影响;病理学检查结果提示BCG-CpG-DNA引起注射部位肌肉的轻微炎症反应,对主要免疫器官无影响。结论 BCG-CpG-DNA对家兔具有较好的安全性。

BCG-CpG-DNA对重组HBsAg的免疫佐剂作用

目的研究BCG-CpG-DNA对重组HBsAg的免疫佐剂作用。方法以BCG-CpG-DNA与重组HBsAg混合免疫小鼠,以铝佐剂疫苗为对照,采用放射免疫法检测抗-HBs中和抗体水平,ELISA法分析抗体亚类,酶联免疫斑点试验(ELIS-POT)检测CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)功能。结果BCG-CpG-DNA能提高抗-HBs中和抗体水平,促进抗原特异性IgG2a的产生,诱导Th1型免疫应答,与铝佐剂协同作用能部分逆转Th2反应。同时能增强抗原特异性CD8+T淋巴细胞的杀伤作用,实验组与对照组比较差异有显著意义。结论BCG-CpG-DNA对HBsAg有较好的免疫佐剂作用,有可能成为一种新型的免疫佐剂。

BCG-CpG-DNA一般毒性的初步评价

目的观察BCG-CpG-DNA对小鼠急性毒性和28d长期毒性作用,评价其一般毒性。方法小鼠分别经背部皮下给予BCG-CpG-DNA100、250和500μg1次(急性毒性试验)和7次(28d长期毒性试验),对照组注射生理盐水。单次给药后观察小鼠的生长情况和体重变化,14d后观察脏器是否发生病变;重复给药期间及末次给药后3周恢复期内,每周观察小鼠外观体征、局部刺激性和体重变化;末次给药后3d及3周检测血液学、血液生化学指标及主要脏器系数和抗双链DNA抗体水平。结果 BCG-CpG-DNA急性毒性试验中,各组小鼠均健康存活,体重增加,无毒性反应。BCG-CpG-DNA28d长期毒性试验中,动物体重、行为活动无异常,给药部位无局部刺激性表现;BCG-CpG-DNA重复给药可提高小鼠免疫细胞的数量;末次给药后3d,各试验组脾脏系数均高于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05),经过3周恢复期回复正常;各试验组血清中抗双链DNA水平与对照组比较,差异无统计学意义,均低于25U/ml的临界值。结论 BCG-CpG-DNA主要影响小鼠的免疫细胞和免疫器官,未见其他明显的急性毒性和长期毒性作用,表明BCG-CpG-DNA具有较好的安全性。

BCG-CpG-DNA重复给药对小鼠免疫毒性的初步评价

目的观察BCG-CpG-DNA重复给药对小鼠免疫器官和免疫功能的影响,评价BCG-CpG-DNA的免疫毒性。方法将BALB/c小鼠随机分为4组,对照组注射生理盐水,实验组分别注射低(100μg)、中(250μg)、高(500μg)剂量的BCG-CpG-DNA,于28d内分别经背部皮下免疫7次,分别于初次免疫后14d、末次免疫后3d和3周,检测各组小鼠免疫器官脏器系数、淋巴细胞转化功能、细胞因子释放(ELISPOT法)、T细胞亚群变化(免疫荧光法)和NK细胞杀伤活性(乳酸脱氢酶法)。结果 BCG-CpG-DNA重复给药7次,主要影响小鼠初级免疫器官,表现为脾肿大,对胸腺、肝脏和肾脏无影响;对细胞免疫功能的影响是增强淋巴细胞转化功能;降低中、高剂量组CD3+T细胞亚群含量;提高体内分泌IFNγ和IL-4的细胞数二者的比例;增强NK细胞的杀伤能力。结论 BCG-CpG-DNA重复给药累计达3.5mg,小鼠表现为免疫功能增强,对免疫器官和免疫功能无不良影响,未见免疫毒性副作用。

斑马鱼模型评价BCG-CpG-DNA的安全性

目的用斑马鱼模型对BCG-CpG-DNA进行安全性评价。方法以斑马鱼胚胎为实验材料,将BCG-CpG-DNA设置4个浓度组(0.15、1.5、15、75 mg/L),暴露斑马鱼,以胚胎培养液暴露为空白对照组,以三甲基氯化锡(TMT)和全氟辛烷磺酸盐(PFOS)暴露为阳性对照组,胚胎期6 hp(f受精后6 h)脱膜,8 hpf进行暴露毒性实验,研究其对斑马鱼发育、遗传、免疫以及行为的毒性影响。每组做3个重复,试验重复3次。结果未观察到BCG-CpG-DNA各浓度组的斑马鱼胚胎明显的畸形和孵化死亡情况,其自主运动、触摸运动、行为检测、免疫强度检测与空白对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。TMT对照组暴露对斑马鱼生长、发育、免疫及其神经等均有不同程度的影响,导致心胞肿大,对光暗刺激反应敏感,相对荧光强度明显增强,嗜中性粒细胞数量增多,对炎症的敏感性增强,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 BCG-CpG-DNA暴露对斑马鱼生长、发育、免疫及其神经均无明显的急性毒性作用,在斑马鱼的胚胎暴露中具有较好的安全性。

新型BC佐剂系统的研究进展

国外已有应用新型佐剂的疫苗上市,国内除铝佐剂广泛应用于疫苗研发生产外,鲜有其他新型佐剂成功上市。本文针对已应用于疫苗临床研究阶段具有自主知识产权的新型BC佐剂系统的来源、发展历史以及生物学活性和免疫机制的研究进展、安全性评价等作一简要综述,为新型疫苗研发中选择该佐剂提供理论支持。

BCG—CpG—DNA对支气管哮喘小鼠肺组织STAT4、STAT6表达的影响

目的观察BCG-CpG-DNA干预对支气管哮喘（简称哮喘）小鼠信号转导和转录激活因子4（sTAT4）、STAT6的影响，探讨其对小鼠哮喘的作用机制。方法将30只BALB／c小鼠随机分为3组：正常对照组（A组）、哮喘模型组（B组）、BCG-CpG-DNA治疗组（C组）。其中B、C组小鼠于第0天、第13天分别给予卵清白蛋白（OVA）和佐剂液态铝混悬液致敏，于第25天至第30天每天给予雾化OVA建立哮喘模型，C组于致敏后以BCG-CpG-DNA腹腔注射，A组以生理盐水代替OVA致敏和激发。所有动物于第31天处死，采用Westernblot技术检测小鼠肺组织中STAT4、STAT6的蛋白表达水平。结果与A组比较，B组STAT4、pSTAT4表达降低（P值均〈0．01），STAT6、pSTAT6的表达升高（P值均〈O．01）；与B组比较，BCG-CpG-DNA治疗后小鼠哮喘症状和肺组织的炎症病理变化减轻，STAT4、pSTAT4表达增加，STAT6、pSTAT6表达降低，差异具有统计学意义（P值均〈0．01）。结论BCG-CpG-DNA可能通过抑制STAT6、促进STAT4的表达，调节Th1／Th2细胞因子平衡，从而起到抑制气道炎症的作用。