miR-153-3p靶向结合BCL2基因调控鼻咽癌细胞增殖、凋亡和周期的实验研究

目的探讨miR-153-3p调控鼻咽癌细胞增殖、凋亡和周期的作用。方法利用生物信息学软件对miR-153-3p的候选靶基因进行预测。实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测miR-153-3p对细胞内mRNA和蛋白表达的影响。用密理博MUSETM细胞检测仪对细胞周期和细胞凋亡情况进行检测。用CCK8法和克隆技术形成实验检测细胞增殖能力。结果生物信息学预测结果显示,miR-153-3p与BCL2分子之间存在一个高可信度的结合区。miR-153-3p mimic能上调miR-153-3p的表达,降低BCL2蛋白的表达。与对照组相比,过表达miR-153-3p的6-10B细胞的凋亡明显增加,增殖能力受到显著抑制。结论miR-153-3p通过下调BCL2的表达,能够促进鼻咽癌细胞凋亡,抑制其增殖。

BCL、RIP细胞凋亡基因向小麦中的导入和赤霉病抗性鉴定

利用农杆菌介导法将BCL和RIP 2个与细胞凋亡有关的基因分别导人了小麦品种扬麦10号和Bobwhite，转化效率分别为1．60％和1．25％。Southern检测结果表明，细胞凋亡基因已稳定整合到小麦染色体上，多数植株为单拷贝整合。Northern检测结果表明，细胞凋亡基因能够在小麦遗传背景中高水平转录为RNA。转基因植株T1代分离比例为2．11～2．33：1，表明外源基因在后代中能够稳定遗传。BCL转基因植株和RIP转基因植株对赤霉病均表现出一定抗性，其中BCL-20、BCL-21、RIP-8、RIP-18等15个T1代植株的小穗发病率为5．6％～16．1％，可望进一步培育抗赤霉病小麦新材料。

胰腺癌细胞凋亡与bcl-2,bax基因的表达

目的 探讨胰腺癌组织中的bcl 2和bax的表达及bcl 2 /bax比值与胰腺癌细胞凋亡的关系。方法 对 30例胰腺癌标本应用免疫组化SP方法测定胰腺癌切片中的凋亡抑制基因bcl 2和凋亡促进基因bax的表达 ;同时应用TUNEL法测定胰腺癌细胞原位凋亡情况。结果 高分化腺癌的凋亡指数 (AI)为 ( 5 .70± 1.2 1) % ;中低分化腺癌为 ( 6 .80± 2 .0 1) %。AI与bcl 2 /bax比值呈负相关关系 (r =-0 .5 5 83,P <0 .0 5 )。结论 bcl 2和bax在胰腺癌细胞凋亡调节过程中起着重要作用。

人天然免疫基因BCL10的猪同源物的识别、克隆与初步表达分析

采用电子克隆方法克隆到大小为925bp的人天然免疫蛋白BCL10的猪同源基因完整cDNA序列(GenBank登录号:EU088132),并利用RT-PCR方法从猪的全血中扩增出包含702bp的完整开放读码框架(ORF)的cDNA片段。经核酸测序,证明与电子克隆结果相符。利用NCBIBLAST分析该cDNA包含3个大小为57bp、289bp和356bp的外显子,并且定位于猪的4号染色体上。采用半定量PCR技术检测基础水平猪各组织BCL10基因mRNA表达丰度,并将该基因构建到带有绿色标签的真核表达载体pEGFP-C1中,采用脂质体转染法将该基因转入PK-15细胞,通过绿色荧光标记和RT-PCR方法检测实验组的BCL10蛋白表达。研究结果表明,BCL10基因mRNA在脾脏中表达最高;胸腺、大脑和淋巴结表达次之,而肝脏只有微量表达,肾脏没有检测到表达;同时BCL10基因在PK-15细胞中得到了有效表达。

BCL10、Nramp1基因多态性与大白仔猪断奶前腹泻关联分析

为研究大白猪BCL10基因和Nramp1基因的单核苷酸多态性,并寻找与大白仔猪断奶前腹泻相关的分子标记,构建490头大白仔猪群体,对仔猪断奶前腹泻情况进行统计,利用PCR-RFLP法检测BCL10基因3′端1149T/C位点和Nramp1基因第六内含子NdeⅠ酶切位点多态性,同时与腹泻频率、腹泻指数和部分生长性状进行关联分析。结果显示:大白仔猪断奶前腹泻率为32.0%,重度腹泻个体的21日龄平均断奶重比正常个体低13.0%,日增重低16.2%,而且大白仔猪在7~11日龄和17~21日龄存在2个断奶前腹泻小高峰。仔猪腹泻粪便病原检测结果表明,22.5%的样本检出为沙门氏菌感染,17.5%的样本检出为致病性大肠杆菌感染。关联分析结果表明:BCL10基因多态性与初生重相关联(P<0.05),TT型个体初生重大于TC型个体,差异显著(P<0.05);BCL10基因多态性与腹泻频率、腹泻指数相关联,差异极显著(P<0.01),个体腹泻频率、腹泻指数均表现为TT>TC>CC,CC与TC之间差异显著(P<0.05),CC与TT之间差异极显著(P<0.01);Nramp1基因多态性与腹泻频率、腹泻指数相关联,差异极显著(P<0.01),个体腹泻频率、腹泻指数均为AA、AB型大于BB型,且AA型与BB型差异显著(P<0.05),AB型与BB型差异极显著(P<0.01)。研究结果表明,BCL10基因和Nramp1基因不同基因型对大白仔猪断奶前腹泻有显著影响,Nramp1基因与猪沙门氏菌感染导致的腹泻有关,BCL10基因3′端1149T/C位点和Nramp1基因第六内含子NdeⅠ酶切位点可以作为大白仔猪断奶前抗腹泻育种分子标记。

BCL11A基因对γ-珠蛋白基因转录的影响

本研究旨在探讨B细胞淋巴瘤/白血病11A(B-cell lymphoma/leukemia 11A,BCL11A)基因对γ-珠蛋白基因转录的影响。通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术沉默人红白血病细胞(K562细胞)的BCL11A基因的表达,用实时荧光定量RT-PCR法定量细胞内γ-珠蛋白基因mRNA水平,分析BCL11A基因对γ-珠蛋白基因转录的调控作用。结果表明,所构建的4个siRNA表达载体对BCL11A基因表达的沉默率分别为49.7%、55.4%、78.2%和84.1%。将沉默率为84.1%的siRNA表达载体转导K562细胞,K562细胞的γ-珠蛋白基因的转录水平较转导对照载体质粒升高了2.4倍。结论:BCL11A基因表达被沉默后γ-珠蛋白基因mRNA水平升高显示BCL11A基因对γ-珠蛋白基因表达可能存在负调控。

实时定量PCR检测白血病中BCL11B基因的表达水平

目的建立BCL11B基因的定量检测方法,并分析其在白血病中的表达水平。方法利用实时定量RTPCR分析TALL(12例)、BALL(8例)、BCLL(6例)、AML(7例)和正常对照(10例)外周血单个核细胞(PBMC)中BCL11B基因的表达水平,以β2微球蛋白(β2M)基因表达水平作为内对照。结果TALL患者PBMC中BCL11B表达水平(553.84±564.01拷贝105β2M拷贝)明显高于正常对照和其他白血病患者(P=0.006,P=0.013,P=0.031,P=0.020);而AML组BCL11B表达水平(0.02±0.04拷贝105β2M拷贝)则明显低于正常对照组(P=0.000)、BALL组(P=0.006)和TALL组(P=0.020);BALL(1.99±1.59拷贝105β2M拷贝)和BCLL(2.26±3.57拷贝105β2M拷贝)中BCL11B表达水平与正常对照(2.20±1.01拷贝105β2M拷贝)无显著差别。结论建立了实时定量RTPCR检测BCL11B方法,TALL中BCL11B高表达可能与其发病有一定关系。

实时定量PCR检测B细胞恶性肿瘤中BCL11A基因的表达水平

目的:建立B细胞淋巴瘤/白血病BCL11A基因的定量检测方法,并分析其在B细胞恶性肿瘤中的表达水平。方法:利用实时定量RT-PCR分析B细胞淋巴瘤(18例)、B细胞性慢性淋巴细胞白血病(B-CLL,8例)、T细胞性急性淋巴细胞白血病(T-ALL,8例)和正常对照(15例)外周血单个核细胞(PBMC)中BCL11A基因的表达水平,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为内对照。结果:B-CLL组和B细胞淋巴瘤组患者PBMC中BCL11A表达水平均明显高于正常对照(P=0.000)和T-ALL组(P=0.000);T-ALL组和正常对照组BCL11A表达水平无显著差别(P=0.084);B-CLL组和B细胞淋巴瘤组BCL11A表达水平无显著差别(P=0.776)。在B细胞淋巴瘤不同的病例中,BCL11A表达水平有较大差异,其中最小值为0.04,最大值为9.70,中位值为1.00。结论:成功建立BCL11A基因的定量检测方法。

卵巢上皮癌bcl-2、p53基因与多药耐药的相关研究

目的 探讨卵巢上皮癌bcl—2、p53基因与肿瘤多药耐药的相关关系。方法 用免疫组化LSAB法检测70例卵巢上皮癌和15例交界瘤的bcl—2、p53基因水平的表达。结果 卵巢癌的bcl—2基因水平呈低表达,浆液性癌、粘液性癌的bcl—2基因表达率分别为11％(5/45)和20％(5/25),交界瘤呈阴性反应。p53抑制基因在浆液性癌、粘液性癌和交界瘤的表达率则分别为77％、72％和0％,P—gp基因在卵巢癌呈高表达,上述三类标本的阳性率分别为88％、80％及33％。结论 bcl—2与p53基因水平的表达与肿瘤细胞的多药耐药相关,bcl—2可作为预测肿瘤预后及药物敏感性的重要指标之一。

沉默Bcl2、Bak1基因表达对成骨肉瘤MG-63细胞增殖及成骨能力的影响

目的探讨沉默Bcl2、Bak1基因表达对成骨肉瘤MG-63细胞增殖及成骨能力的影响。方法收集对数生长期MG-63细胞,随机分为sh Bcl2组、sh Bak1组、共转染组和空白对照组。sh Bcl2组、sh Bak1组、空白对照组分别单独转染sh Bcl2、sh Bak1重组腺病毒和空载腺病毒,共转染组同时转染sh Bcl2及sh Bak1重组腺病毒。转染48 h,采用MTT法检测细胞增殖率,对硝基苯磷酸盐法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,Western blotting法检测成骨相关蛋白骨形态发生蛋白4(BMP4)、骨桥蛋白(OPN)、Runt相关转录因子2(Runx2)、TNF-α表达。结果 sh Bcl2组细胞增殖率、ALP活性及BMP4、OPN、Runx2相对表达量均低于空白对照组,TNF-α相对表达量高于空白对照组(P均<0.01)。sh Bak1组细胞增殖率、ALP活性及BMP4、OPN、Runx2相对表达量均高于空白对照组,TNF-α相对表达量低于空白对照组(P均<0.01)。空白对照组与共转染组细胞增殖率、ALP活性、BMP4、OPN、Runx2、TNF-α相对表达量比较均无统计学差异(P均>0.05)。结论沉默Bcl2基因表达可抑制MG-63细胞增殖及成骨能力,沉默Bak1基因则具有相反的作用;Bcl2与Bak1共同参与MG-63细胞的凋亡及成骨过程。

β-珠蛋白生成障碍性贫血患者血红蛋白F表达与BCL11A基因rs11886868位点单核苷酸多态性的关系

本研究通过分析β-珠蛋白生成障碍性贫血患者的血红蛋白F(HbF)表达及BCL11A基因rs11886868位点的单核苷酸多态性,探讨二者之间的关系。选取89例已知基因突变类型的轻型β-珠蛋白生成障碍性贫血患者,通过毛细管电泳分析患者的红细胞HbF含量;提取患者基因组DNA,通过聚合酶链反应扩增含rs11886868位点的BCL11A基因片段,用DNA测序法确定rs11886868位点的单核苷酸多态性。结果显示,在89例深圳地区β-珠蛋白生成障碍性贫血患者的BCL11A基因rs11886868位点中发现C和T两种单核苷酸多态性;携带C/C单倍型患者的红细胞HbF含量为(4.47±3.42)%,高于携带C/T单倍型患者的(2.79±2.21)%。结论:β-珠蛋白生成障碍性贫血患者BCL11A基因rs11886868位点存在C和T两种单核苷酸多态性,其中C多态性可能与红细胞内HbF高表达存在相关性。

硼替佐米对急性单核细胞白血病细胞株SHI-1诱导凋亡作用及其对Bcl2l12、Bcl-2和Bax基因表达影响

本研究探讨蛋白酶抑制剂硼替佐米对急性单核细胞白血病细胞株SHI-1增殖和凋亡的影响及Bcl2l12、Bcl-2和Bax基因在其中的作用。用MTT比色法观察硼替佐米对SHI-1细胞的生长抑制作用,用Annexin-V标记、线粒体跨膜电位(Δψm)和DNA凝胶电泳分析细胞凋亡,用RT-PCR方法检测0、6,12和24小时Bcl2l12、Bcl-2和Bax基因表达。结果表明,硼替佐米呈时间和剂量依赖性抑制SHI-1细胞生长,24小时和48小时半数抑制浓度分别为54.13 nmol/L和5.45 nmol/L;硼替佐米能够诱导SHI-1细胞凋亡,在6小时Annexin-V阳性细胞就开始增高并呈时间依赖性,Δψm减低,形态学可见明显细胞核凝聚、固缩和碎裂,DNA凝胶电泳显示DNA片段化;RT-PCR显示,Bcl2l12表达增高,Bcl-2表达减低,但Bax表达无明显改变。结论:硼替佐米抑制SHI-1细胞增殖,并可能通过上调Bcl2l12基因和下调Bcl-2基因,使线粒体膜电位下降而促使SHI-1细胞发生凋亡。

RNA干扰下调bcl11b基因表达对Molt-4细胞增殖和凋亡的影响

目的分析下调bcl11b基因表达对人T淋巴细胞白血病细胞株Molt-4细胞增殖和凋亡的影响。方法通过核转技术将bcl11b-siRNA转染Molt-4细胞;在不同时间点分别采用荧光实时定量PCR观察其对bcl11b基因表达的影响;MTT法观察对Molt-4细胞体外增殖的抑制作用;流式细胞术及刘氏染色检测siRNA的诱导凋亡作用。结果转染后24小时开始细胞生存率均显著降低(P<0.01),细胞发生凋亡,bcl11b基因表达下调。结论bcl11b-siRNA可抑制Molt-4细胞中bcl11b基因表达,使肿瘤细胞增殖抑制和发生凋亡。

人Bcl2基因真核表达载体的构建及其抗凋亡功能研究

目的:构建带myc标签的Bcl2真核表达载体,获得myc-Bcl2融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增Bcl2编码序列,将其插入p CMV-myc载体,Western印迹检测表达情况;将重组质粒与空载体分别转染乳腺癌MCF-7细胞,通过流式细胞仪检测p CMV-myc-Bcl2重组质粒对细胞凋亡的影响。结果:双酶切和测序结果表明p CMV-myc-Bcl2真核表达质粒构建成功;转染293T细胞后myc-Bcl2蛋白成功表达;流式细胞仪检测结果显示,myc-Bcl2明显抑制乳腺癌细胞系的凋亡。结论:构建了带myc标签的人Bcl2真核表达载体,为进一步研究Bcl2在细胞凋亡中的功能奠定了基础。

小鼠bcl10基因敲除载体的构建

根据已知的cDNA序列设计引物 ,通过RT PCR获得小鼠bcl10基因cDNA片段作为探针 ,用噬斑原位杂交法克隆 12 9品系小鼠的bcl10基因组DNA ,在亚克隆完成序列结构分析的基础上 ,利用常规分子克隆技术 ,构建完成了针对bcl10基因的替代型基因敲除载体。两条同源臂分别为bcl10基因exon3上游 2 .4kb和exon4下游 4 .5kb的基因片段。构建完成替代型小鼠bcl10基因敲除载体 ,为后续获得bcl10基因缺陷型胚胎干细胞系奠定了实验基础。

Bcl-xl基因对硝普钠诱导SY5Y细胞凋亡的抑制作用

【目的】研究Bcl-xl基因对成人神经母细胞廇SH-SY5Y细胞毒性的影响。【方法】将构建好的Bcl-xl基因重组真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl转染SH-SY5Y细胞,并分为正常组、pIRES2-EGFP空质粒转染组、pIRES2-EGFP/Bcl-xl质粒转染组,利用凋亡诱导剂硝普钠(50μmol/L)诱导各组细胞凋亡,行Hoechst33258细胞染色对比观察各组细胞凋亡情况,通过MTT法分析各组细胞存活率。RT-PCR与Western blotting检测转染后Bcl-xl基因的表达情况。【结果】转染SH-SY5Y细胞后,检测结果显示Bcl-xl基因能够高效转染并在此细胞中蛋白表达。相对于未转染细胞来说,转染细胞能部分对抗硝普钠诱导的凋亡,MTT显示有统计学意义(P<0.05)。【结论】Bcl-xl基因能够通过升高基因的表达抑制NO诱导的类神经元细胞死亡,同时也能间接说明硝普钠产生的NO对细胞的毒性可能大部分是通过凋亡途径来产生的。

石蜡切片荧光原位杂交检测弥漫性大B细胞淋巴瘤BCL6基因异常

目的建立石蜡包埋的淋巴瘤组织切片荧光原位杂交(FISH)技术平台,探讨其在弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)诊断中的价值。方法应用家用高压锅和水浴变性法在淋巴瘤石蜡切片上行FISH分析,BCL6双色断裂点分离探针FISH检测58例石蜡包埋DLBCL病例中BCL6基因易位和扩增。结果通过优化实验条件,成功地建立了淋巴瘤石蜡切片FISH方法;DL-BCL中BCL6基因易位和扩增的发生率分别为24.1%(14/58)和17.2%(10/58),BCL6基因异常的检出率为39.7%(23/58)。结论石蜡包埋的淋巴瘤组织切片可用于FISH分析;FISH检测BCL6基因异常有助于DLBCL的诊断。

T-ALL/淋巴瘤中BCL11B基因转录本的分析

目的:分析T-ALL/淋巴瘤中BCL11B基因转录本的特点。方法:利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时定量聚合酶链式反应(RQ-PCR)方法分析12例T-ALL/淋巴瘤外周血单个核细胞(PBMC)中BCL11B基因的表达情况;限制性内切酶消化确定PCR产物的特异性。结果:3例T-ALL/淋巴瘤患者中出现2种BCL11B转录本:野生型和第3外显子缺失型,其余9例均表达第3外显子缺失型的转录本。两组病人PBMC中BCL11B表达水平无显著差别(P=0.301)。结论:3例T-ALL/淋巴瘤病人中存在2种BCL11B基因转录本,但在表达水平上无明显差别。

应用RNAi沉默STAT3基因促裸鼠移植瘤细胞凋亡及对Bax/Bcl-2基因表达的影响

目的应用RNAi技术沉默信号转导子与转录活化子3(STAT3)基因,探讨其对人乳腺癌裸鼠移植瘤的细胞凋亡及其对Bax/Bcl2基因表达的影响。方法于雌裸鼠皮下种植MCF7细胞,肿瘤长至一定大小时,随机分为盐水对照(A)组、空质粒对照(B)组及实验(C)组。于肿瘤局部分别注射盐水、psilencer1.0U6空质粒和psilencer1.0U6STAT3siRNA重组质粒。当A组肿瘤长至足够大时处死全部动物,取肿瘤,测其大小及重量,行HE及免疫组化染色,同时用Westernblot检测STAT3,Bax,Bcl2基因的表达水平。结果C组肿瘤瘤块的体积和重量明显小于A,B组(P<0.01)。免疫组化及HE显示C组肿瘤中心区出现大面积细胞坏死及细胞凋亡征象,STAT3免疫组化呈阴性,而A,B组无此现象。Westernblot显示C组STAT3的表达明显低于A,B组(P<0.01),而Bax的表达明显高于A,B组(P<0.05),各组Bcl2的表达水平差异无显著性(P<0.05)。结论应用RNAi技术沉默STAT3基因可以降低人乳腺癌裸鼠移植瘤中STAT3的表达,同时引起Bax基因的表达上调,导致细胞凋亡进而抑制肿瘤的生长。

NR3C1基因Bcl1多态性与青少年抑郁:压力性生活事件的调节作用

迄今,有关抑郁的基因×环境交互研究多数基于"单胺缺陷假说",相对较少有研究以"HPA轴假说"为框架考察抑郁的遗传机制,且忽视了基因-环境相关的影响。本研究对1081名青少年进行追踪研究,考察NR3C1基因Bcl1多态性与压力性生活事件对抑郁的影响。结果发现,经历较多压力性事件时,C等位基因携带者的抑郁水平显著高于GG纯合子携带者;经历较少压力性事件时,不同基因型携带者的抑郁水平无差异。此外,通过区分独立性压力性事件和预测早期抑郁进一步排除了基因-环境相关的影响,在一定程度上验证了结果的可靠性。