Bak1腺病毒表达载体的构建及对人成骨肉瘤细胞的影响

目的构建人Bcl2拮抗1(Bak1)基因重组表达腺病毒pAd-Bak1,并感染人成骨肉瘤细胞MG63建立过表达Bak1的细胞模型,检测其对细胞活性的影响。方法利用qPCR扩增Bak1全长cDNA,利用穿梭质粒pENTER构建载有Bak1基因的重组穿梭质粒pENTER-Bak1,通过基因测序鉴定载体序列。将重组载体PmeⅠ线性化、脱磷酸化后,转入含有腺病毒骨架质粒pAd-Amp的感受态BJ5183细胞中进行基因同源重组。将重组腺病毒质粒pAD-Bak1经PacⅠ酶切线性化后,用Lipofectamine 2000脂质体转染到HEK-293细胞中进行包装扩繁,荧光定量PCR法测定病毒滴度。感染MG63细胞,qPCR和Western blot检测Bak1的表达,MTT检测细胞活性。结果测序及酶切验证pENTER-Bak1构建成功。pAD-Bak1感染MG63细胞,qPCR检测到细胞中Bak1基因过表达(与NC对照组和空白对照组相比P<0.01、P<0.01),Western blot检测到细胞中Bak1蛋白过表达。MTT检测显示与NC对照组相比,细胞活性减弱(P<0.05)。结论成功构建了Bak1重组表达腺病毒,验证了其能够感染MG63细胞表达Bak1蛋白,证明了过表达Bak1可以减弱细胞的活性。为进一步研究Bak1的功能奠定了基础。

BAK和BAG-1蛋白在结直肠癌中的表达及其意义

目的探讨BAK和BAG-1蛋白在结直肠癌中的表达及其意义。方法采用免疫组化SP法对80例结直肠癌、40例结直肠腺瘤及25例癌旁正常结直肠黏膜组织中BAK和BAG-1蛋白的表达进行检测,并分析其与结直肠癌临床病理特征之间的相关性。结果 BAK和BAG-1蛋白在结直肠癌中过度表达,表达率分别为72.5%(58/80)和80%(64/80),且BAG-1蛋白与肿瘤的分化程度呈负相关,BAK蛋白与肿瘤的分化程度呈正相关。有淋巴结转移的结直肠癌,其BAG-1蛋白的表达率为96.7%(29/30),无淋巴结转移的结直肠癌,其BAG-1蛋白的表达率为70%(35/50),两者相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论 BAK和BAG-1蛋白的过度表达与肿瘤的分化程度密切相关,且BAG-1蛋白的过度表达还与肿瘤的淋巴结转移密切相关;结直肠癌的发生机制可能涉及BAK和BAG-1调节环路中多个基因的异常。