人B细胞成熟抗原的克隆、表达及纯化

目的构建人B细胞成熟抗原(BCMA)原核表达质粒,表达BCMA融合蛋白。方法通过RT-PCR方法从人B淋巴瘤Raji总RNA中扩增BCMA的全长cDNA,并插入原核表达载体PGEX4T-1的BamHI和NotI酶切位点,构建原核表达载体PGEX4T-1-BCMA,利用酶切和序列分析方法验证所构建质粒的正确性。在大肠杆菌中表达BCMA融合蛋白,并经谷胱甘肽-S-转移酶(GST)亲和柱纯化。纯化后的产物经过SDS-PAGE、Western blot检测目的蛋白的表达情况。结果 BamHI/NotI双酶切证明重组质粒中含有目的大小的BCMA基因片段,序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确。将所构建的PGEX4T-1-BCMA质粒转染感受态DH5α,IPTG诱导表达后超声裂解菌体,上清经GST亲和纯化,经SDS-PAGE、抗GST和BCMA抗体Western blot分析,证实融合表达蛋白为GST-BCMA融合蛋白。结论成功构建了BCMA原核表达载体,重组质粒能够在原核表达系统中可溶性表达GSTBCMA融合蛋白,为进一步研究BCMA的生物学功能奠定了基础。

BCMA-Fc-Myc融合蛋白的构建、表达及活性鉴定

目的:旨在可溶性BAFF受体末端加上myc标签,构建BCMA-Fc-myc,用于竞争ELISA分析BAFF拮抗肽-Fc同BCMA-Fc-myc与BAFF的竞争性结合能力。方法:通过PCR法获得BCMA-Fc-Myc基因,进而构建重组子pET28a-BCMA-Fc-Myc,转入E.coli BL21(DE3)中进行融合蛋白的表达。采用蛋白A凝胶亲和柱进行纯化以及ELISA法检测其生物活性。结果:成功获得了BCMA-Fc-Myc重组基因和pET28a-BCMA-Fc-Myc重组子。并表达和纯化得该融合蛋白,且其能够与BAFF特异性结合。结合活力呈现剂量依赖性,浓度50ng/μl时,两者的吸附达饱和。结论:此研究表达的BCMA-Fc-Myc融合蛋白具有结合BAFF的生物活性,可作为其他融合蛋白竞争性ELISA的对照蛋白,为用于筛选BAFF拮抗肽的竞争ELISA实验平台。