BVDV、BRV和BCoV TaqMan三重RT-qPCR检测方法的建立

为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)和牛冠状病毒(BCoV)的快速检测方法,根据GenBank中登录的BVDV 5'-UTR、BRV NSP5和BCoV N基因序列设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和条件,建立了同时检测上述3种病毒的TaqMan三重RT-qPCR方法。该方法仅对BVDV 5'-UTR、BRV NSP5和BCoV N基因扩增呈阳性,而对牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒、魏氏梭菌(A型、B型和D型)、多杀性巴氏杆菌(A型和B型)等犊牛腹泻相关病原扩增均呈阴性;最低检出限为10拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于2%。利用本研究建立的TaqMan三重RT-qPCR方法对29份临床样品进行检测,获得BVDV、BRV、BCoV的4种混合感染型,其中BVDV与BCoV的混合感染率最高(27.6%);与已有单重RT-qPCR方法比较,发现两种方法检测BVDV、BRV和BCoV的符合率分别为100%、96.5%、100%。结果表明,本研究建立的TaqMan三重RT-qPCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、可行性高等优点,可为今后BVDV、BRV和BCoV共感染引起的牛腹泻性疾病的鉴别诊断和流行病学调查提供新技术手段。

茯苓多糖参与调节BCoV诱导的宿主细胞IFN-β信号通路细胞因子的表达

以牛肾细胞(MDBK)细胞为研究对象,MDBK细胞接种牛冠状病毒(BCoV),应用Real-time PCR检测茯苓多糖对BcoV N基因表达水平及BcoV诱导的MDBK细胞中RLR干扰素信号通路上相关细胞因子表达水平的影响。结果,茯苓多糖可抑制BCoV N基因的表达;茯苓多糖可促进RLR通路细胞因子RIG-I、MDA5、MAVS、TBK1、IRF3及IFN-β的表达,并缓解BCoV对宿主细胞RIG-I、MDA5、MAVS、TBK1、IRF3及IFN-β细胞因子的前期抑制。结果表明,茯苓多糖可调节RLR通路细胞因子表达水平,抑制BCoV病毒的复制。这一研究结果为茯苓多糖治疗BCoV引起的犊牛腹泻提供了理论依据。

Remarks on BCOV invariants and degenerations of Calabi-Yau manifolds

For a one parameter family of Calabi-Yau threefolds, Green et al.(2009) expressed the total singularities in terms of the degrees of Hodge bundles and Euler number of the general fiber. In this paper,we show that the total singularities can be expressed by the sum of asymptotic values of BCOV(BershadskyCecotti-Ooguri-Vafa) invariants, studied by Fang et al.(2008). On the other hand, by using Yau's Schwarz lemma, we prove Arakelov type inequalities and Euler number bound for Calabi-Yau family over a compact Riemann surface.

牛冠状病毒S基因的序列分析及原核表达

为了解牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)的S基因变异情况并建立ELISA检测方法,本研究对采自不同牛场的新生犊牛腹泻(CD)和成年牛冬痢(WD)腹泻样本提取总RNA,反转录合成cDNA,利用PCR扩增S全基因和S1基因。将S1基因目的片段连接表达载体pET-32a(+),并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经PCR、双酶切及测序验证正确后,进行IPTG诱导表达。结果显示,CD与WD分离株S基因核苷酸为98.4%,CD和WD分离株与参考毒株BCoV-ENT株核苷酸同源性最高,分别为98.4%和98.5%,CD分离株与参考毒株SUN5株的同源性最低,为97.5%,WD分离株与FRA/EPI/Caen/2003/13同源性最低,为97.3%。通过比对可知,分离株与已知毒株之间存在较大差异,为疫苗候选毒株筛选提供依据。本试验同时构建了pET-32a-S1表达载体,在0.2mmol/L IPTG诱导5h时,重组菌能在大肠杆菌BL21感受态细胞中产生大量的S1融合蛋白,获得约58ku表达产物。本试验成功表达了S1蛋白,并对BCoV进行了核苷酸进化分析,为疫苗免疫效果评价方法的建立奠定了基础。

2017-2018年山东省奶牛场犊牛腹泻相关病毒病原学检测

为了解山东省奶牛养殖场中引起犊牛腹泻相关病毒的流行情况,2017-2018年,在全省13个地区51家规模化奶牛养殖场,采集624份犊牛腹泻病料样品,进行牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、牛冠状病毒(BCo V)和牛轮状病毒(BRV)PCR检测,并对检测结果采用SPSS 20.0软件进行数据统计以及显著性差异分析(Pearson卡方检验)。结果显示:BVDV、BEV、BCo V、BRV个体检出率分别为34.58%、11.78%、8.84%、17.70%,群体检出率分别为47.83%、38.89%、35.71%、33.33%,BVDV检出率显著高于其他3种病毒(P<0.01),且有流行加重趋势;鲁西北、鲁中、鲁西南、半岛地区4种病毒的检出率有差异,其中鲁中地区的BVDV检出率明显高于其他地区(P<0.01)。结果表明,BVDV、BEV、BCo V、BRV 4种病原在山东省奶牛场中流行广泛,以BVDV流行最为严重,尤其是鲁中地区,且有流行加重趋势,成为导致奶牛场犊牛腹泻的主要病毒性因素,建议有针对性地开展防控与净化。本检测初步摸清了山东省不同地区引起奶牛犊牛腹泻相关病毒的感染情况,可为山东省制定奶牛腹泻病综合防控措施提供数据支撑。

2020年四川省部分地区腹泻牛群牛冠状病毒感染情况调查

为了解四川省主要养牛地区腹泻牛群中牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)感染情况,采集眉山、南充、达州、巴中、雅安、甘孜等6个市州53个场户的牛腹泻粪便样品共387份,采用荧光RT-PCR方法进行BCoV检测。结果显示:53个场点中,检出阳性场点11个,群体阳性检出率为20.8%;387份样品中,检出阳性样品65份,个体阳性检出率为16.8%。从群间分布看,规模场群体阳性检出率(72.7%)与个体阳性检出率(21.4%)均高于散养户(7.1%和3.1%),差异均极显著(P<0.01);牦牛个体阳性检出率为28.8%,高于黄牛(14.1%)和奶牛(11.1%),差异均有统计学意义,分别为P<0.01和P<0.05。结果表明,BCoV在四川省已形成一定的污染面,是造成牛腹泻的重要病原之一,需要加强对其流行的综合防控。

牛冠状病毒N蛋白抗体库构建与单链抗体筛选

为快速筛选获得牛冠状病毒(BCoV)特异性抗体,本试验用重组的牛冠状病毒N蛋白免疫BALB/c小鼠,从免疫小鼠脾细胞中提取总RNA,反转录成cDNA后,分别扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,采用重叠延伸PCR法将VH、VL拼接为完整的单链抗体(scFv)基因,将scFv基因与酶切的噬菌粒连接,电转入感受态细胞中,过夜培养获得初级噬菌体抗体库,测定库容为8×10^(8)PFU。自库中随机挑取15个单克隆的噬菌体通过PCR鉴定,结果显示其中13个克隆扩增出约800 bp大小的目的片段,阳性率为86.7%,说明噬菌体抗体库构建成功。该抗体库经4轮富集淘选和酶联免疫吸附试验检测,最终获得32株与N蛋白特异性反应的噬菌体克隆。将32株阳性克隆进行PCR鉴定并测序,分析序列后发现有19株阳性单链抗体基因正确,选取阳性值较高的5株阳性单链抗体检测其噬菌体抗体结合活性,其中阳性单链抗体scFv-154与N蛋白的结合活性较高。本试验为进一步探讨单链抗体在牛冠状病毒病诊断和防控技术领域的应用提供了依据。

牛冠状病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

针对牛冠状病毒(BCoV)N基因保守序列设计合成了1对特异性引物,以体外转录法制备的cDNA标准品为模板,建立了检测BCoV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。在1个反应体系中模板最低检测限为7.8 copies/μL,比普通RT-PCR更加灵敏;与牛主要消化道和呼吸道病毒病病原均无交叉反应;批内、批间重复变异系数均低于1.5%;应用定量PCR检测了39份疑似临床病料,阳性检出率为51.28%(20/39),普通RT-PCR为41.03%(16/39)。结果表明,该方法特异性强、稳定性好、准确率高,本方法将为BCoV的临床诊断和流行病学调查提供技术保障。

云南省部分地区牛冠状病毒检测及其N基因序列分析

为深入了解云南省牛冠状病毒(bovine coranarirus,BCoV)在不同地区、不同年龄牛群中的流行情况,2021-2022年采集大理、陆良、石林、寻甸等4个地区5家牛场不同年龄牛的粪便样品357份(腹泻样品61份、非腹泻样品296份)进行BCoV RT-PCR检测,并对BCoV阳性样品进行N基因测序分析。结果显示:在357份粪便样品中,检出BCoV阳性51份,总样品检出率为14.29%,5家牛场均有阳性检出,场阳性率为100%;1周龄、1周龄-1月龄、1~6月龄、1岁以上牛粪便样品的BCoV检出率分别为10.00%、19.23%、10.81%、17.31%;腹泻样品BCoV检出率为36.07%,非腹泻样品为9.78%。通过扩增得到4条完整的BCoVN基因序列;经同源性与遗传进化分析,4条N基因序列高度保守,相互间核苷酸同源性为99.0%~99.8%,与国内参考毒株处于同一小分支,亲缘关系近,核苷酸同源性为97.7%~99.9%,与美国4-17-03、7-16-23、4-17-25和日本GF2020等毒株处于同一个大分支且遗传距离较近;与美国原始毒株Mebus处于不同的大分支,亲缘关系较远,核苷酸同源性为98.1%~98.2%。结果表明:云南省牛群中可能广泛存在BCoV流行,1周龄—1月龄犊牛感染发病风险最高,调运或引种导致BCoV在国内传播的可能性较大。因此,需加强BCoV流行的监测与控制,严格进行检疫,加快疫苗研发和应用。

内蒙古自治区部分地区规模化牛场牛冠状病毒流行病学调查

为了解内蒙古地区规模化牛场牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)的流行情况,试验分别采用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法对2020年采自内蒙古部分地区规模化牛场的500份血液样本的BCoV抗体和580份粪便样本的BCoV抗原进行检测,对不同地区、月龄和季节的BCoV抗体和抗原阳性率进行统计。结果表明:500份血液样本的BCoV抗体总阳性率为48.80%,其中呼和浩特市为51.50%,鄂尔多斯市为48.33%,巴彦淖尔市为45.00%;0~2月龄、3~6月龄、7~18月龄、18月龄以上牛血液样本的BCoV抗体阳性率分别为55.29%、40.00%、35.00%、52.94%;春季、夏季、秋季、冬季牛血液样本的BCoV抗体阳性率分别为67.22%、16.67%、23.75%、52.22%。580份粪便样本的BCoV抗原总阳性率为18.79%,其中呼和浩特市为16.79%,鄂尔多斯市为14.44%,巴彦淖尔市为30.00%;不同月龄牛均存在不同程度的BCoV感染,0~2月龄、3~6月龄、7~18月龄、18月龄以上牛粪便样本的BCoV抗原阳性率分别为34.42%、10.00%、11.76%、8.42%;春季、夏季、秋季、冬季牛粪便样本的BCoV抗原阳性率分别为25.94%、1.67%、15.29%、16.84%。说明内蒙古地区BCoV呈普遍流行趋势,在春季牛更易感染BCoV,0~2月龄牛更易感染BCoV,因此应做好内蒙古地区BCoV的防控工作,并加强对易感牛群BCoV的血清学、病原学监测,实时调整疫病防控措施,减少牛腹泻疾病的发生。

四种牛病毒性呼吸道病一步法多重PCR方法的建立与应用

牛病毒性呼吸道病(BRD)是一种世界性的并且由多个因素引起的传染病,也是危害我国牛养殖业的主要因素。本研究分别选取保守基因IBRV gB基因、BCoV N基因、BRSV F基因、BPIV3 HN基因,设计特异性引物,建立了IBRV、BCoV、BRSV、BPIV3一步法多重PCR检测方法,并对一步法多重PCR方法反应体系与反应程序进行优化。一步法多重PCR的退火温度、延伸时间、循环数、引物浓度、酶用量分别为60℃、30 s、30次、0.6μmol/L、1.6μL。该方法对IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3的最低检测限分别为3.72×10^(-3)、3.14×10^(-6)、2.86×10^(-4)、2.92×10^(-6)ng/μL。利用所建立的一步法多重PCR方法对临床90份样品进行检测,与经典单重PCR检测方法相比,阳性符合率为100%。

牛冠状病毒BCV-Aks-01新疆南疆株全基因组序列测定及其分子特征分析

为掌握牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)BCV-Aks-01新疆南疆株的全基因组序列、分子结构特征及遗传变异情况。本研究以新疆南疆某牛场BCV-Aks-01阳性样本为基础,以GenBank中BCoV参考株设计扩增引物和测序引物,提取样本中病毒核酸,对BCV-Aks-01株进行全基因组扩增、测序、构建系统发生树及序列分析。结果表明,BCV-Aks-01新疆南疆株为BCoV,其全基因组长为30 975bp,与GenBank收录的参考株比较,核苷酸同源性高达98.8%,属于β类冠状病毒2a亚类,具有β类冠状病毒共同结构特征。首次获得BCV-Aks-01新疆南疆株全基因组序列并阐明了其基因组分子结构特征。

我国14省市呼吸道综合征患牛冠状病毒感染的检测

牛冠状病毒(bovine coronavirus, BCoV)是导致牛消化道和呼吸道疫病的主要病原之一,其在国内养殖业的感染报道较少。本试验对牛冠状病毒感染情况及其与临床罹患呼吸道疾病综合征犊牛的临床症状相关性开展研究。在奶牛养殖量较大的14个省市随机选择29个规模化牧场,对未断奶的犊牛进行呼吸道疾病综合征评估,选取单一症状典型的犊牛采集血清和鼻咽拭子。在176份样品中BCoV阳性共38份,阳性率为21.59%。统计发现,采自黑龙江的病料中冠状病毒检出率最高(70%),新疆次之,山西、上海、安徽未检出BCoV阳性样品;阳性病例与呼吸道疾病疾病综合征临床症状的相关性分析表明,病畜的发热、鼻腔分泌物性状改变与感染牛冠状病毒密切相关。本研究为牛冠状病毒感染导致犊牛呼吸道疾病综合征的临床诊断提供了参考。

牛冠状病毒纳米PCR检测方法的建立及初步应用

为了更加快速地检测牛冠状病毒(BCoV),本试验根据BCoV的具有较高保守性的N基因序列设计1对特异性引物,结合纳米金颗粒材料,通过反应条件和体系优化,建立一种新型的快速灵敏的BCoV检测方法,并应用于临床检测。特异性试验与敏感性试验结果表明,本试验建立的nano-PCR方法对BCoV特异,与牛轮状病毒(BRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)均无交叉反应。nano-PCR的敏感性是普通PCR的100倍,普通PCR最低核酸检测量为2.24×10^(3)copies/μL,nano-PCR最低核酸检测量为2.24×10^(1)copies/μL。应用所建立的方法对采集的43份腹泻牛的粪拭子、鼻拭子、肺部组织样品进行检测,检出BCoV阳性样品17份,普通PCR检出阳性样品11份,两种方法的符合率为100%。此次建立的nano-PCR在检测牛冠状病毒时具有更高的特异性和敏感性,对临床上的快速诊断及检测具有一定的意义。

牛冠状病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种敏感、特异的牛冠状病毒(BCoV)实时荧光定量RT-PCR检测方法,试验利用GenBank中BCoV参考毒株N基因序列,设计引物及小沟结合物(MGB)探针,建立实时荧光定量RT-PCR方法,对方法的特异性、灵敏度和稳定性进行检验。利用建立的方法对采集自7个省份31个发病牛场的925份临床样本进行检测,并用基于BCoV N基因的普通RT-PCR结合测序的方法对部分阳性样品进行验证。结果表明:建立的实时荧光定量RT-PCR方法的扩增体系为上下游引物(10μmol/L)各1μL,探针(10μmol/L)0.8μL,2×One Step RT-PCR BufferⅢ10μL,Ex Taq HS(5 U/μL)0.4μL,Prime Script RT Enzyme MixⅡ0.4μL,总RNA 2μL,ddH_(2)O 4.4μL;扩增程序为,42℃5 min;95℃10 s;95℃5 s,55℃35 s,40个循环。标准曲线方程为y=40.979-3.512x,可信度(R^(2))为0.999,扩增效率(E)为92.6%,最低检测限为48 copies/μL,重复性变异系数(CV)不超过0.82%。31个发病牛场BCoV阳性场占比为64.52%(20/31),其中腹泻症状阳性场占比为54.55%(12/22),呼吸道症状阳性场占比为65.22%(15/23);阳性样品经基于BCoV N基因的普通RT-PCR方法验证,测序正确。说明建立的BCoV实时荧光定量RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,能检测出临床样本中的BCoV核酸,可应用于BCoV感染的诊断、监测与流行病学调查。