慢病毒介导bcr/abl基因RNAi对白血病K562细胞生物学特性的影响

目的:研究慢病毒介导RNAi致bcr/abl基因长期沉默对K562白血病细胞各种生物学特性的影响。方法:构建含bcr/ablRNAi序列的pNL-B/A-EGFP慢病毒重组质粒载体并包装病毒,感染K562细胞,挑取稳定转化的克隆(B/A-K562)。Real-time PCR及Western blotting验证干扰效应;锥虫蓝染色、集落形成实验检测细胞增殖能力变化;联苯胺染色观察细胞分化;ELISA法检测酪氨酸激酶活性;AO-EB染色观察细胞凋亡;比色法检测Caspase-3、Caspase-9活性;以上检测均以K562细胞和转染空质粒EGFP-K562作对照。结果:成功构建bcr/abl基因RNAi稳定转染的B/A-K562细胞,Real-time PCR及Westernblotting证实B/A-K562细胞中bcr/ablmRNA及P210bcr/abl蛋白含量明显下调。bcr/abl基因稳定下调后,K562细胞倍增时间明显延长(37.1vs20.4、23.3h)、集落形成能力减弱(P<0.01),K562细胞向红系分化,酪氨酸激酶活性下降(P<0.01),自发凋亡率显著提高(P<0.01),细胞中Caspase-3(P<0.05)及Caspase-9(P<0.01)活性明显提高。结论:慢病毒介导的RNAi能实现bcr/abl基因长期沉默,从而抑制K562细胞恶性增殖,诱导其分化及凋亡。

双色双融合荧光原位杂交探针检测慢性髓系白血病Bcr/Abl基因重排的研究

本研究探讨双色双融合荧光原位杂交技术(DC-DF-FISH)在慢性髓系白血病(CML)中的应用价值,应用常规R-显带技术、DC-DF-FISH、RT-PCR技术检测41例CML患者的染色体核型及bcr/abl融合基因。结果表明,对于初诊CML的18例患者,R-显带显示Ph染色体阳性检出率为94.4%(17/18),DC-DF-FISH阳性检出率也为94.4%(17/18),对于治疗后CML的18例患者,R-显带显示14例有可分析分裂相,其中有11例存在Ph染色体,阳性检出率为78.6%(11/14);而用DC-DF-FISH检测治疗后患者的阳性率为94.4%(17/18);移植后的5例患者R-显带均未检出Ph染色体,而FISH检测出1例bcr/abl基因阳性,RT-PCR证实了FISH的检测结论,但在移植患者中,RT-PCR无阳性发现。结论:双色双融合荧光原位杂交技术具有高度的准确性、可靠性,是检测CML患者bcr/abl基因重排的可靠方法,适用于CML的诊断、疗效判定及微小残留病灶的检测。

bcr/abl基因b3-a2型接合区cDNA的分离和序列分析

利用分子生物学方法,我们将K562细胞林bcr/abl mRNA 0.3kb的接合区cDNA片段用聚合酶链反应扩增并插入到质粒pGEM-4-Z载体中。经限制酶切分析和荧光标记M13引物法DNA序列测定,证实重组质粒pB3A2中有0.3kb的插入片段与K562 mRNA接合区序列完全一致。我们分离到的接合区DNA可用于bcr/abl基因的检测及其反义核酸抑制的研究。

TEC启动子介导BCR/ABL基因在BaF3细胞中的表达

转P210bcr/abl基因小鼠是研究慢性髓系白血病的理想模型,但广泛表达的启动子容易引起转基因小鼠的胚胎致死,所以应用在造血细胞中特异表达的启动子是成功建立转P210bcr/abl基因小鼠模型的关键。本研究探讨TEC启动子介导BCR/ABL基因在BF3细胞中的表达。从小鼠的基因组中克隆TEC启动子的-364至+22区域,并替换掉IRES2-eGFP载体的CMVie启动子,同时在该载体的EcorⅠ酶切位点插入7.2 kb的P210bcr/abl基因,再将构建好的载体分别转染BaF3细胞和293细胞,观察eGFP基因与P210bcr/abl基因在2种细胞中的表达情况。结果通过荧光显微镜和流式细胞仪检测发现,eGFP基因在BaF3细胞成功表达,表达率在转染后6、24、72 h分别为7.10%、23.35%和64.61%,而在293细胞中未见eG FP基因表达。RT-PCR在BaF3细胞中扩增出BCR/ABL mRNA中372 bp的片段,而在293细胞中未扩增出任何片段。结论:TEC启动子的-364至+22区域能介导相关基因在造血细胞中高效特异性表达,适合于构建转P210bcr/abl基因小鼠模型。

bcr/abl基因修饰树突细胞疫苗诱导CTLs杀伤K562细胞体外实验研究

背景与目的:T细胞介导的特异性免疫效应在慢性粒细胞白血病的治疗中发挥着重要作用,而以树突细胞(dendriticcell,DC)为中心的免疫治疗是目前肿瘤生物免疫学治疗的热点之一。本研究以复制缺陷型重组腺病毒为载体,介导慢性粒细胞白血病bcr/abl基因片段转导DC制备疫苗,观察bcr/abl基因修饰DC疫苗诱导产生的特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)在体外对白血病K562细胞的杀伤效应。方法:应用RT-PCR法扩增慢性粒细胞白血病bcr/abl基因片段,构建复制缺陷型重组腺病毒质粒,并包装产生重组腺病毒。体外诱导培养外周血单个核细胞来源DC,观察DC分别经重组腺病毒转染及多肽负载后,诱导产生特异性的CTLs在体外对白血病K562细胞的杀伤效应。结果:成功构建了携带bcr/abl基因片段的复制缺陷型重组腺病毒表达载体,包装产生的重组腺病毒滴度高达2.0×1010pfu/mL。体外转染DC效率达到50%～60%,成功制备了bcr/abl特异性DC疫苗。体外实验中,在40:1和20:1效靶比下,bcr/abl基因修饰DC疫苗对K562细胞的杀伤效应分别为(47.6±4.7)%和(47.5±1.6)%,多肽负载DC为(25.8±4.4)%和(24.6±6.3)%,空白DC为(5.7±1.3)%和(4.5±1.6)%,基因修饰DC疫苗诱导的杀伤效应明显高于多肽负载及空白组(P<0.05)。结论:以重组腺病毒为载体介导bcr/abl基因片段转导DC制备的基因修饰DC疫苗,具有显著的诱导CTLs杀伤白血病K562细胞的作用。

慢性粒细胞白血病bcr/abl基因检测在造血干细胞移植过程中的临床意义

目的探讨慢性粒细胞白血病(CML)bcr/abl基因检测的临床意义,以及移植后治疗效果及预后监测等方面的价值。了解慢性粒细胞白血病融合基因表达、染色体改变及细胞学的改变与临床诊断和治疗的关系。方法采用实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测15例CML患者移植前、后bcr/abl融合基因的表达;染色体制备采用骨髓短期培养法,G显带,分析核型。结果对照组bcr/abl基因表达、Ph染色体均为阴性;15例患者移植前:bcr/abl基因表达阳性率为100%(15/15),表达量范围4.7×104～3.2×108copies/L;Ph染色体分析结果中,13例为Ph(+)/bcr(+),2例为Ph(-)/bcr(+)。细胞学分析结果 :呈CML的细胞学改变。移植后1个月bcr/abl融合基因转阴率为80%,2个月转阴率达93%,3个月转阴率达100%。Ph染色体均为阴性。另外,0.5～3年内有13%(2/15)的患者bcr/abl基因表达呈阳性,6%(1/15)的患者Ph(+),有复发的阳性指标。结论 bcr/abl基因表达水平的定量检测及动态观察,对CML的临床诊断、移植后疗效判断及预后的监测具有重要意义.

bcr/abl基因与白血病的关系

ｂｃｒ／ａｂｌ基因是Ｐｈ染色体的分子基础，Ｐｈ染色体是慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）的遗传学特征，见于９０％～９５％的ＣＭＬ病例［１］。而在５％的儿童急性淋巴细胞性白血病（ＡＬＬ），１０％～２５％的成人ＡＬＬ及３％～５％的急性非淋巴细胞性白血病（ＡＮＬ...

Tet-off调控bcr/abl基因表达的细胞系293pT2-P210的建立

慢性髓系白血病(CML)是一种以髓系细胞受累为主的克隆性疾病。目前认为CML的主要分子发病基础为:位于9q34的abl基因与位于22q11的bcr基因相互易位形成bcr/abl融合基因,并编码具有很强蛋白酪氨酸激酶活性的P210bcr/abl融合蛋白,该蛋白通过多种信号通路抑制细胞凋亡而导致细胞转化。本研究为构建能由Tet-off诱导表达系统调控bcr/abl融合基因表达的细胞系,为深入研究bcr/abl融合基因功能及其调控机制提供一种有价值的细胞模型。将bcr/abl融合基因亚克隆到pTRE2hyg载体构建重组质粒pT2-P210,同时将Tet-off质粒转染293细胞并筛选出单克隆,然后进一步转染pTRE2hyg-LUC质粒,通过荧光素酶活性检测选出能有效诱导目的基因表达的293Tet-off细胞,然后将重组质粒pT2-P210转染到293Tet-off细胞中。结果表明:筛选出了bcr/abl融合基因能被强力霉素有效调控的293pT2-P210单克隆细胞。结论:本研究筛选的293pT2-P210细胞为bcr/abl基因表达能被Tet-off诱导表达系统调控的细胞系,它们适用于bcr/abl融合基因功能及其信号调控机制的深入研究。

BCR/ABL基因对PTEN介导的信号通路在K562细胞增殖和凋亡中的影响

目的:探讨BCR/ABL融合基因对抑癌基因PTEN介导的信号传导通路在K562细胞增殖和凋亡中的影响。方法:用不同浓度的格列卫(0.5、1、2、5、10μg/ml)干预K562细胞不同时间,观察其对细胞增殖的影响。用1μg/ml浓度的格列卫干预K562细胞不同时间(12、24、36、48、72h)后,通过荧光定量PCR检测细胞BCR/ABL、PTEN、mTOR mRNA水平的变化,并分析它们之间的相互关系。Western blotting检测细胞Akt和p_Akt水平,分析BCR/ABL融合基因对PTEN mRNA表达的影响。结果:1μg/ml格列卫作用K562细胞后随着BCR/ABL融合基因表达减低,PTEN mRNA表达上调,mTOR mRNA表达下调,p_Akt表达下调。48h后随着BCR/ABL融合基因的抑制减弱,PTEN mRNA表达进而减低,而mTOR mRNA表达升高,p_Akt持续降低。BCR/ABL mRNA表达与PTEN mRNA表达呈负相关(r=-0.881,P<0.05),与mTOR mRNA及p_Akt表达呈正相关(依次为r=0.961,r=0.879,P均<0.05)。结论:BCR/ABL融合基因可以通过抑制PTEN基因表达,调控PI3K/Akt、mTOR信号传导通路,参与细胞增殖、凋亡及细胞周期调控等生物学特性。

慢性粒细胞性白血病bcr/abl基因检测的临床意义

目的探讨慢性粒细胞性白血病(CML)bcr/abl基因检测的临床意义。方法采用荧光定量PCR(FQPCR)检测112例CML患者bcr/abl融合基因的表达。结果对照组bcr/abl基因表达均为阴性。112例CML患者bcr/abl基因表达阳性率为88.39%(99/112),表达值范围(3.2～7.8)×107copies/L;67例CML患者费城染色体(Ph染色体)分析结果中,51例为Ph(+)/bcr(+),5例为Ph(-)/bcr(+),9例Ph(+)/bcr(-),2例Ph(-)/bcr(-);17例CML患者α干扰素(INFα)治疗前bcr/abl基因表达均值为(2.60±0.9)×107copies/L,INFα治疗后为(1.82±0.57)×107copies/L,两者具有显著性差异(P<0.05)。结论bcr/abl基因表达水平的定量检测及动态观察,对CML的临床诊断、疗效判断及预后具有重要意义。

磷酰肌醇-3激酶途径与bcr/abl基因介导的白血病细胞增殖和抗凋亡信号传导

目的探讨磷酰肌醇-3激酶途径在K562、NB4和HL60细胞增殖和凋亡抗性中的不同作用。方法短期培养法直接法G显带检测K562细胞和CML患者骨髓原代细胞的染色体核型,RQ-PCR检测K562细胞和CML患者骨髓原代细胞的bcr/abl基因;用磷酰肌醇-3激酶特异抑制剂渥曼青霉素(WT)抑制磷酰肌醇-3激酶活性,经细胞生长曲线测定、半固体集落形成实验、流式细胞膜联蛋白V标记技术检测细胞凋亡百分比和凋亡指数。观察K562、NB4和HL60细胞增殖能力及凋亡抗性的变化。统计学采用t检验。结果K562细胞G显带检出Ph染色体,RQ-PCR检测K562细胞存在bcr/abl基因;与标准Ph染色体表达的CML患者骨髓原代细胞的bcr/abl基因完全吻合;K562、NB4和HL60细胞在24h、48h、72h的增殖抑制率分别为41.33%、57.46%、65.85%和26.29%、5.51%、2.10%及32.14%、17.14%、13.14%。生长曲线显示WT抑制磷酰肌醇-3激酶途径可显著抑制K562细胞的增殖(P<0.05),而对NB4和HL60细胞增殖无明显影响(P>0.05)。K562、NB4和HL60细胞加和不加WT,培养14d后的集落形成率分别为:16.15%和7.60%,5.90%和6.10%,6.60%和6.40%。集落形成抑制率为52.94%、3.39%和3.03%。WT抑制磷酰肌醇-3激酶途径可显著抑制K562细胞的集落形成(P<0.05),而对NB4和HL60细胞集落形成无明显影响(P>0.05)。K562、NB4和HL60细胞加WT,AraC,WT+AraC作用24h后的凋亡细胞百分比分别为(17.27±1.94)%、(17.00±3.36)%、(27.60±4.36)%;(13.25±4.12)%、(20.55±8.57)%、(17.56±7.97)%;(11.60±1.27)%、(22.07±5.62)%、(20.50±7.97)%。凋亡指数分别为8.91±3.86、6.88±2.66、13.39±4.49;7.79±2.75、9.35±4.19、7.61±6.35;3.03±0.56、3.79±0.93、5.27±2.69。提示渥曼青霉素抑制磷酰肌醇-3激酶途径可促进由AraC诱导下的K562细胞的凋亡(P<0.05),而对NB4和HL60细胞凋亡无明显影响(P均>0.05),NB4和HL60细胞凋亡主要受药物的细胞毒作用。结论渥曼青霉素可以通过抑制磷酰肌醇-3激酶通路抑制K562细胞的增殖,促进K562细胞的凋亡。磷酰肌醇-3激酶途径通路是bcr/abl基因介导的白血病细胞增殖和抗凋亡信号传导的重要信号传导途径。

慢性粒细胞白血病病人Mcl-1和Bcr/Abl基因表达

目的探讨慢性粒细胞白血病(CML)病人Mcl-1基因和Bcr/Abl融合基因的表达水平及临床意义。方法应用实时荧光定量PCR技术检测了41例CML病人(包括慢性期15例、加速期6例、急变期6例、伊马替尼治疗后遗传学完全缓解8例及非伊马替尼治疗的未缓解的CML病人6例)骨髓标本Mcl-1基因、Bcr/Abl融合基因的表达水平,以10例正常人作为对照。结果 CML各组Mcl-1和Bcr/Abl mRNA的表达水平差异均有显著性(χ2=19.12～36.08,P<0.05)。伊马替尼治疗组与正常对照组Mcl-1 mRNA的表达明显低于其他各组(Z=2.547～3.254,P<0.05);加速期、急变期及非伊马替尼治疗组之间Mcl-1 mRNA的表达水平差异无显著性(Z=0.481～1.922,P>0.05),但均明显高于慢性期(Z=2.650～3.465,P<0.05)。Bcr/Abl mRNA在慢性期、加速期、急变期及非伊马替尼治疗组之间表达差异无显著性(Z=0.480～1.196,P>0.05)。CML病人Mcl-1与Bcr/AblmRNA的表达水平呈正相关(r=0.68,P<0.05)。结论 Mcl-1和Bcr/Abl与CML的病情密切相关,参与CML的发生和发展,是判断病情进展及预后的分子标记物。

慢性粒细胞白血病Bcr/Abl基因OD域融合蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化慢性粒细胞白血病(CML)Bcr/Abl基因OD域融合蛋白。方法将TAT、OD和HA基因片段顺次克隆入pET32a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒pTAT-OD-HA,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coliBL2(lDE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析后,用镍离子亲和层析柱纯化。结果所构建的重组质粒pTAT-OD-HA经PCR、双酶切及测序鉴定正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30000,诱导6h蛋白表达量达最高,约为10%;Westernblot分析显示,该蛋白可与鼠抗HA单克隆抗体发生特异性反应;纯化后纯度约为95%。结论已成功原核表达并纯化了TAT-OD-HA融合蛋白,为进一步研究其在CML中的作用奠定了基础。

慢性粒细胞白血病和真性红细胞增多症bcr/abl融合基因表达及临床意义

目的：探讨慢性粒细胞白血病和真性红细胞增多症ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因出现的频率及临床意义。方法：采用逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，研究了慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）、真性红细胞增多症（ＰＶ）ｂｃｒ／ａｂｌ基因的变化。结果：４８ 例慢性期ＣＭＬ，４３ 例呈现ｂｃｒ／ａｂｌ基因阳性，占８９．６％ ，１４ 例加速，急变期ＣＭＬ，６ 例出现ｂｃｒ／ａｂｌ基因，阳性率为４２．９％ ，与慢性期ＣＭＬ相比Ｐ＜ ０．０１；１０ 例ＰＶ出现１ 例ｂｃｒ／ａｂｌ基因阳性，占１０．０％ 。结论：ｂｃｒ／ａｂｌ基因检测对于ＣＭＬ的临床分型有重要意义，ｂｃｒ／ａｂｌ阴性的ＣＭＬ预后差，而ｂｃｒ／ａｂｌ基因的阳性有助于初诊时的ＣＭＬ急变与急性非淋巴细胞白血病（ＡＭＬ）Ｍ２ 的鉴别和ＣＭＬ与慢性粒单细胞白血病（ＣＭＭＬ）的鉴别。

慢性粒细胞白血病和原发性骨髓纤维化患者bcr/abl融合基因表达及临床意义

目的 探讨bcr/abl融合基因的表达水平在慢性粒细胞白血病(CML)和原发性骨髓纤维化(MF)患者的诊断、疗效及预后观察中的意义。方法 采用荧光定量逆转录多聚酶链反应(RT -PCR)技术,对18例初、复治CML、7例MF患者的骨髓或外周血单个核细胞进行了bcr/abl融合基因检测,并对其中2例行异基因骨髓移植(allo -BMT)患者进行了短期随防。结果 13例慢性期(CP)CML ,12例不同程度表达bcr/abl融合基因,占92 .3% ,3例加速期(AP) ,急变期(BC)CML ,2例表达bcr/abl融合基因,占6 6 .7% ,2例患者allo -BMT后一年内未检出bcr/abl融合基因,三者之间有非常显著差异P <0 .0 1;8例初诊患者WBC数及bcr/abl融合基因表达水平明显高于常规治疗组;7例MF患者有1例表达bcr/abl基因。结论 bcr/abl基因是CML发病的分子基础,定量检测bcr/abl融合基因对于CML的诊断、临床分型、疗效观察及预后判断有重要意义;MF患者可能与CML关系密切,对MF患者应进行跟踪观察。

定量PCR监测干扰素联合阿糖胞苷治疗慢性粒细胞白血病患者bcr／abl基因表达的临床意义

目的:评价bcr／ab1融合基因作为观察治疗慢性粒细胞白血病(CML)疗效指标的临床价值。方法:采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应技术检测28例经干扰素(IFN)联合阿糖胞苷(Ara-C)治疗的CML患者bcr／ab1 mRNA水平。结果:骨髓Ph染色体数与bcr／ab1融合基因水平具有较强的相关性(r=1．74,P<0．01)。IFN联合Ara-c治疗CML 6个月后完全持续缓解8例,部分缓解11例,主要细胞遗传学反应为67．85％。结论: bcr／ab1融合基因可能是治疗CML疗效观察和微小残留病灶监测的有效指标。

异基因造血干细胞移植治疗bcr/abl融合基因阳性急性白血病的临床疗效观察

目的:观察异基因造血干细胞移植治疗bcr/abl融合基因阳性急性白血病的临床疗效。方法:对MICM分型确诊的18例bcr/abl融合基因阳性急性白血病患者,采用化疗或加用酪氨酸激酶抑制剂达完全缓解后行异基因造血干细胞移植术。结果:18例行异基因造血干细胞移植术后,均获得造血及免疫功能重建。9例无病存活;1例复发,经治疗后再次达完全缓解;8例死亡,其中因复发死亡3例,移植相关死亡5例。2a无病生存率为(31.6±14.0)%,2a总生存率为(48.0±13.9)%;中位无病生存时间(9.0±3.1)个月,中位总生存时间(18.0±8.0)个月。结论:异基因造血干细胞移植是目前治愈bcr/abl融合基因阳性急性白血病的惟一有效手段,联合酪氨酸激酶抑制剂能有效提高长期生存率。

bcr/abl融合基因检测在慢性粒细胞白血病诊断及残留病灶监测中的应用

目的探讨bcr／abl融合基因检测在诊断慢性粒细胞性白血病（CML）和监测CML残留病灶中的意义。方法采用巢式逆转录PCR（RT—PCR）检测337例CML患者bcr／abl融合基因的表达，并对所有患者进行残留病灶的动态监测，共检测632人次。其中移植（包括外周血干细胞移植、骨髓移植和脐血移植）患者26例；服用格列卫的患者22例；其它治疗方案患者289例。结果在337例CML初诊患者中bcr／abl基因表达阳性者325例，阳性率为96．4％；其中b3a2型转录本占58．5oA（190／325），b2a2型转录本占41．2％（134／325），b3a3型转录本占0．3％（1／325）。未发现b2a3型转录本。移植患者bcr／abl融合基因转阴率为88．5％（23／26），时间在30～201d之间，中位数为55d；服用格列卫患者融合基因总转阴率59．1％（13／22），转阴时间在用药后90～365d之间，中位数为210d；其它治疗组患者转阴12例，转阴率为4．1％（12／289）。结论bcr／abl融合基因的检测及动态观察，对CML的临床诊断、疗效及预后判断具有重要意义。

青黛复方对K-562细胞Bcr/Abl融合基因及p210蛋白表达的影响

目的探讨青黛复方对K-562细胞调亡、Bcr/Abl融合基因及p210蛋白的影响。方法以不同浓度青黛复方(0、2.5、5、7.5、10和20mg/ml)处理K-562细胞24h后,采用半定量RT-PCR技术检测各组Bcr/Abl融合基因的表达,Western blot技术检测p210Bcr/Abl蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果随药物作用浓度升高,K-562细胞凋亡率呈浓度依赖性增加;Bcr/Abl在mRNA和蛋白水平均呈浓度依赖性下调,尤以10mg/ml和20mg/ml处理组更为显著。结论青黛复方能部分抑制K-562细胞Bcr/Abl的表达并呈浓度依赖关系,其对慢性髓细胞性白血病(CML)的疗效可能是通过促进细胞凋亡而实现的。