FAK shRNA抑制白血病BCR/ABL-BaF3细胞生长

目的:本实验研究黏着斑激酶(FAK)shRNA对白血病细胞生长的影响。方法:构建FAK shRNA慢病毒载体,转染至BCR/ABL-BaF3白血病细胞株,同时建立空白载体对照细胞株。通过蛋白质印迹方法检测FAK等蛋白表达情况,体外观察白血病细胞在RPMI-1640完全培养基生长以及在甲基纤维素半固体培养基集落形成。将BCR/ABL-BaF3经尾静脉注射到BALB/c小鼠体内建立白血病动物模型,观察小鼠生存情况,分析白血病细胞在小鼠脾脏的分布情况。结果:FAK shRNA能有效沉默FAK基因表达,降低STAT5蛋白磷酸化水平,并引起caspases-3活化。体外实验发现FAK shRNA能明显抑制白血病细胞生长。集落形成实验中,空白载体对照组与FAK shRNA组中细胞集落数量分别为215.60±13.01和125.00±9.06,2组差异显著(P<0.01)。白血病动物实验发现空白载体对照组小鼠生存时间是21-27 d,而FAK基因沉默组小鼠生存时间是52-60 d,2组差异显著(P<0.05)。白血病输注后第25 d,空白载体对照组与FAK shRNA组小鼠脾脏中白血病细胞所占百分比分别为(82.40±6.13)%和(14.50±3.70)%,2组差异显著(P<0.01)。结论:体外实验及动物体内实验均证实FAKshRNA能明显抑制白血病细胞生长,提示FAK基因沉默有望成为白血病治疗的新策略。

稳定表达BCR／ABL的小鼠BaF3-P210细胞株的建立及其生物学特性的研究

目的构建能稳定表达BCR/ABL的小鼠转化细胞株BaF3-P210,并初步探讨BCR/ABL对BaF3细胞生物学特性的影响。方法将含有bcr/abl基因的逆转录病毒载体转染到包装细胞,收集病毒感染BaF3细胞,经筛选和亚克隆,获得稳定表达BCR/ABL的转基因BaF3-P210细胞。用PCR、DNA测序、RT-PCR和Westernblot检测bcr/abl基因在靶细胞中的整合和表达;用台盼蓝细胞计数法、流式细胞仪(FCM)和MTT法研究BCR/ABL对BaF3细胞生物学特性的影响。结果bcr/abl基因整合在BaF3细胞基因组中,BaF3-P210细胞能稳定表达bcr/abl基因及其蛋白。与对照组相比,BaF3-P210细胞增殖速度增快(P<0.05);G0/G1期细胞比例下降,S期和G2/M期细胞比例增高(P<0.05);经STI571处理后的细胞增殖抑制率为(54.08±1.90)%(P<0.05),早期凋亡率为(12.35±2.04)%(P<0.05)。结论成功构建的能稳定表达BCR/ABL的小鼠BaF3-P210转化细胞株具有增殖能力增强、细胞周期进程加速和对STI571敏感的恶性表型特征。

BCR／ABL融合基因和转录因子FoxO3a在初发和急变慢性粒细胞白血病患者中的表达变化

目的:观察慢性粒细胞白血病(CML)初发和急变患者外周血BCR/ABL融合基因和转录因子FoxO3a的表达变化及其意义。方法:利用EVA Green建立实时荧光RT-PCR检测BCR/ABL、FoxO3a和GAPDH的方法,检测25例CML初发和25例CML急变患者的外周血样本中BCR/ABL融合基因和FoxO3a的表达,以及30例正常人外周血样本中FoxO3a的表达,以GAPDH为内参基因,各组基因表达水平的差异采用△△CT相对定量法。结果:CML急变患者外周血BCR/ABL融合基因的表达水平是初发患者的4.72倍,正常人外周血样本中FoxO3a的表达水平分别是CML初发和急变患者的143.39倍和8.18倍。结论:BCR/ABL融合基因的高表达与转录因子FoxO3a的低表达可能与CML不同阶段的病理过程相关联。

Bcr3/abl2和VEGF基因反义寡核苷酸联用增强对K562细胞的生长抑制作用

目的:研究BCR ABL和VEGF反义寡核苷酸联用对K5 62细胞株的作用及其相互作用的影响。方法:设计针对bcr3/abl2和VEGF的反义寡核苷酸(AS ODNs) ,应用脂质体Oligofectamine作为转染载体。在转染后72h进行台盼蓝染色细胞计数;建立裸鼠K5 62移植瘤动物模型,瘤内注射AS ODNs,观察肿瘤体积生长变化,组织学检测肿瘤血管密度和肿瘤细胞凋亡情况。结果:转染后72h ,各实验组与空白组相比,细胞增殖抑制率分别为1 3 .47% (ASO B3/A2组) ,1 2 . 79%(ASO VEGF组)和41 . 5 5 % (半量联合治疗组)。经过4次治疗后,与对照组相比,肿瘤生长抑制率分别为2 3 .1 8% (ASO B3/A2组) ,1 7. 2 8% (ASO VEGF组)和5 7 .83% (半量联合治疗组)。联合治疗组肿瘤生长速率显著低于单一治疗组,伴随明显的肿瘤细胞凋亡增加和肿瘤血管密度减少。结论:双基因反义寡核苷酸联合应用协同抑制K5 62细胞增殖,抗肿瘤作用明显优于单一治疗组,可为CML基因治疗提供一项新策略。

B细胞BCR CDR3受体库的高通量测序分析概况

B细胞是介导机体体液免疫应答的主要细胞群,其识别、结合抗原主要依赖互补决定区（CDR）,它决定着抗体的特异性,而互补决定区3（CDR3）比CDR1、CDR2更具多样性,通过观察机体B细胞BCR CDR3受体库的多样性、重叠率的大小、

温热处理对K562细胞系bcr/abl融合基因mRNA转录和Caspase-3表达的影响

目的观察不同温度刺激对K562细胞bcr/abl融合基因mRNA转录和Caspase-3蛋白表达的影响。方法将培养获得的K562细胞分别进行40℃、43℃、46℃恒温刺激30min,以37℃作为对照;RT-PCR技术检测bcr/abl融合基因mRNA的转录,Westernbloting技术检测Caspase-3的表达。结果K562细胞热刺激30min后,bcr/abl融合基因mRNA的转录随温度升高而下调,Caspase-3的表达随温度升高而上调。结论温热刺激可降低K562细胞内bcr/abl融合基因mRNA的转录,提高Caspase-3的表达。

TEC启动子介导BCR/ABL基因在BaF3细胞中的表达

转P210bcr/abl基因小鼠是研究慢性髓系白血病的理想模型,但广泛表达的启动子容易引起转基因小鼠的胚胎致死,所以应用在造血细胞中特异表达的启动子是成功建立转P210bcr/abl基因小鼠模型的关键。本研究探讨TEC启动子介导BCR/ABL基因在BF3细胞中的表达。从小鼠的基因组中克隆TEC启动子的-364至+22区域,并替换掉IRES2-eGFP载体的CMVie启动子,同时在该载体的EcorⅠ酶切位点插入7.2 kb的P210bcr/abl基因,再将构建好的载体分别转染BaF3细胞和293细胞,观察eGFP基因与P210bcr/abl基因在2种细胞中的表达情况。结果通过荧光显微镜和流式细胞仪检测发现,eGFP基因在BaF3细胞成功表达,表达率在转染后6、24、72 h分别为7.10%、23.35%和64.61%,而在293细胞中未见eG FP基因表达。RT-PCR在BaF3细胞中扩增出BCR/ABL mRNA中372 bp的片段,而在293细胞中未扩增出任何片段。结论:TEC启动子的-364至+22区域能介导相关基因在造血细胞中高效特异性表达,适合于构建转P210bcr/abl基因小鼠模型。

反义bcr/abl寡核苷酸诱导K562细胞凋亡时Caspase3表达及活性的变化

目的 :用反义 bcr/abl寡核苷酸片段诱导 K562细胞凋亡 ,观察 Caspase3表达及活性变化 ,以阐明 Caspase3在慢性髓性白血病 ( CML)发病机制中的作用。方法 :用反义 bcr/abl寡核苷酸片段 AS和对照无义片段 NS处理 CML急变细胞系 K562 ,检测细胞凋亡及 Caspase3表达和活性的变化。结果 :K562细胞经 AS处理 72 h,流式细胞仪检测未见亚二倍体细胞增多。原位末端标记法显示 AS组 2 4 h始出现细胞凋亡增多 ,72 h达高峰 ,为 ( 78.50± 6.60 ) % ,较对照组 ( 1 8.2 1± 3.32 ) %及 NS组 ( 2 4 .1 3± 4.1 7) %明显增多 ( P<0 .0 5)。Western blot检测显示 ,培养 72 h AS组 Caspase3原酶及 p17活性亚单位的表达增强。荧光分光光度法测定 Caspase3活性示 ,AS处理 1 2 h Caspase3活性即已升高 ,48h达高峰 ,为处理前的 4.71倍。对照组及NS组上升幅度较小 ,72 h最高 ,分别为处理前的 2 .78倍和 2 .30倍。结论 :Caspase3参与了 CML的 bcr/abl基因抑制细胞凋亡的作用。

PI3K在BCR/ABL阳性细胞中促进细胞周期进程和抗凋亡的作用

BCR/ABL阳性细胞中,磷酯酰肌醇-3-激酶(PI3K)途径是BCR/ABL激活的一条重要途径,它对于BCR/ABL阳性细胞恶性表型的维持是必不可少的。现对PI3K在BCR/ABL阳性细胞中促进细胞周期进程和抗凋亡的作用和机制作一综述。

BCR3/ABL2核酶的设计、构建及对K562细胞增殖与集落形成的抑制作用和凋亡诱导作用

利用计算机模拟设计合成了针对 K5 62细胞致癌融合 bcr3/abl2 m RNA的锤头状核酶 .该核酶以融合点附近 UUC为识别切割三联体 ,在核酶的 3′端增加一段 T7噬菌体终止子序列 .用基因克隆结合体外转录的方法 ,肯定了核酶的体外切割活性 .进而将核酶基因克隆到 p CEP4真核细胞高效表达载体上 ,利用脂质体 Lipofectin AMINE介导的转染技术将核酶与核酶基因导入靶细胞 ,从抑制靶细胞 K5 62的增殖与集落形成及引起靶细胞凋亡等方面验证了核酶在细胞水平上对融合基因 bcr3/abl2 m RNA的特异切割作用 ,并观察到了 T7噬菌体终止子序列对核酶切割效率的增强影响 .

Bcr/abl阳性慢性粒细胞白血病中ASB2和Jak3基因mRNA表达的研究

目的研究Bcr/abl阳性慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓中单个核细胞ASB2和Jak3基因mRNA的表达,探讨Bcr/abl阳性CML中蛋白泛素化与Jak-STAT信号通路的相关性。方法收集初诊确诊为Bcr/abl阳性CML的患者32例(CML组)及34例非白血病和健康人(对照组)作为研究对象,采集骨髓标本,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测ASB2mRNA和Jak3mRNA表达情况。结果 CML组骨髓细胞中ASB2mRNA、Jak3mRNA表达量相对于对照组分别升高了29.9、548.7倍,两组ASB2mRNA、Jak3mRNA表达量差异有统计学意义(P<0.01),且在Bcr/abl阳性CML患者中二者呈正相关(r=0.571,P<0.01)。结论 Bcr/abl阳性CML患者骨髓细胞中ASB2与Jak3有异常表达,蛋白泛素化与Jak-STAT信号通路的交联可能与白血病的发生、发展有关,并且初次在人体骨髓细胞中证明ASB2与Jak3共同升高具有相关性。

磷酰肌醇-3激酶途径在CML细胞增殖和抗凋亡中的作用

为探讨磷酰肌醇-3激酶(PI3K)通路在CML细胞增殖和抗凋亡中的作用,作者应用沃氏篮酶素(Wortmannin,WT)特异性地抑制PI3K激酶活性,经细胞生长曲线测定、半固体集落培养和流式细胞膜联蛋白 V(Annexin V)标记技术,观察了K562和NB4细胞增殖能力与凋亡抗性的改变。结果:WT显著抑制K562细胞增殖能力,24,48及72小时增殖抑制率分别为23.13％。45.17％和60.42％,集落形成抑制率为53.91％(均P<0.05),而对NB4细胞的增生无明显影响;WT可促进由Vp16诱导的K562细胞凋亡。凋亡指数提高1.49倍,NB4细胞的凋亡指数无显著改变。上述结果证明了PI3K在CML细胞增殖和抗凋亡中占重要地位。

三氧化二砷对慢性粒细胞白血病细胞系的作用(英文)

本研究探讨三氧化二砷 (As2 O3)对两种慢性粒细胞白血病 (CML)细胞系有无作用及作用机制。实验选用了两种不同的CML细胞系KU81 2和MEG 0 1及两种其它白血病细胞系U937和PL2 1 ,加入不同浓度的As2 O3(0 .2 ,2和 1 0 μmol/L) ,在不同时间计数活细胞数 ,观察细胞形态 ,并以TUNEL法和DNA凝胶电泳检测细胞有无凋亡的发生 ;同时检测 0 .2 μmol/LAs2 O3作用时细胞表面CD34 ,CD1 3 ,CD33 ,CD1 9,CD1 1b ,CD1 4和CD7的变化 ,并通过RT PCR检测细胞bcr abl水平及caspase 3的变化。研究结果发现 ,不同浓度的As2 O3对 4种细胞系的作用不同 ,1 0 μmol/L时 4种细胞系均会发生细胞凋亡 ,2 μmol/L时则仅CML细胞系KU81 2和MEG 0 1会产生凋亡 ,0 .2μmol/L时 4种细胞系均不发生凋亡。在培养 2 4小时后 ,4种细胞系表面的CD34 ,CD1 3 ,CD33 ,CD1 9,CD1 1b ,CD1 4和CD7等均无明显改变。RT PCR检测bcr abl的水平发现在 2种CML细胞系中无明显改变 ,其caspase 3的活性较对照细胞均有所增加。结论 :As2 O3在较高浓度下可诱导 4种白血病细胞系产生凋亡 ,在 2 μmol/L仅可诱导CML来源的两种细胞系产生凋亡 ,CML细胞系对As2 O3较其它两种细胞系敏感 ,其作用机制与caspase

同卵双胞胎与B细胞的研究进展

B细胞是机体体液免疫应答的关键部分,B细胞表面的B细胞受体(B cell receptor,BCR)分子是识别抗原的关键分子。同卵双胞胎来自于同一受精卵,具有相同的遗传物质,在评估遗传、环境等多因素对疾病的影响中起着不可替代的作用。本文在同卵双胞胎B细胞对肿瘤,自身免疫病以及其他疾病的免疫应答做了概括,同时也对目前关于同卵双胞胎BCR组库的特征及可能重排机制研究成果做出综述。

bcr3-abl2多肽诱导脐血T细胞受体Vβ亚家族T细胞克隆性增殖的研究

目的 了解bcr3 abl2多肽诱导T细胞受体 (TCR)Vβ亚家族T细胞克隆性增殖情况。 方法 以人工合成bcr3 abl2多肽联合IL 2 +抗CD3单克隆抗体 (单抗 )诱导脐血T细胞增殖 ,运用RT PCR 基因扫描技术分析其TCRVβ亚家族的利用和克隆性特点。结果 bcr3 abl2多肽成功诱导 3份脐血单个核细胞 (MNC)产生多肽特异T细胞。bcr3 abl2多肽和CD3单抗 +IL 2均可诱导脐血T细胞扩增 ,多肽诱导的新增Vβ亚家族表达与不加多肽的CD3单抗 +IL 2诱导组的T细胞不完全相同。培养前和单用CD3单抗 +IL 2诱导后的T细胞绝大多数为多克隆性 ,而bcr3 abl2多肽诱导 1周或 2周后 ,分别在 3例脐血中诱导出寡克隆增殖和呈寡克隆增殖趋势T细胞。结论 bcr3 abl2多肽可在体外诱导出抗慢性粒细胞白血病细胞的脐血特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL) ,该CTL作用可能是由优势表达的Vβ亚家族克隆性T细胞所介导。

Wortmannin抑制PI3K途径对bcr/abl基因介导的白血病细胞增殖和凋亡抗性影响的研究

目的探讨磷酰肌醇-3激酶(PI3K)途径在K562、NB4和HL60细胞增殖和凋亡抗性中的不同作用。方法用磷酰肌醇-3激酶(PI3K)特异抑制剂Wortmannin(WT)抑制PI3K活性,经细胞生长曲线测定、半固体集落形成实验、流式细胞膜联蛋白V(Annexin-V-Flous)标记技术检测细胞凋亡百分比和凋亡指数。观察K562、NB4和HL60细胞增殖能力及凋亡抗性的变化。结果K562、NB4和HL60细胞在24、48、72h的增殖抑制率分别为41.33%、57.46%、65.85%和26.29%、5.51%、2.10%及32.14%、17.14%、13.14%。生长曲线显示WT抑制PI3K途径可显著抑制K562细胞的增殖,对NB4和HL60细胞增殖无明显影响。K562、NB4和HL60细胞加和不加WT,培养14d后的集落形成率分别为16.15%和7.60%,5.90%和6.10%,6.60%和6.40%。集落形成抑制率为52.94%、3.39%和3.03%。K562、NB4和HL60细胞加WT、AraC、WT+AraC作用24h后的凋亡细胞百分比分别为(17.27±1.94)%、(23.25±14.12)%、(17.60±1.27)%;(17.00±3.36)%、(20.55±8.57)%、(22.07±5.62)%;(27.60±4.36)%、(17.56±9.28)%、(20.50±7.97)%。凋亡指数分别为(6.88±2.66)、(7.79±2.75)、(3.03±0.56);(8.91±3.86)、(9.35±4.19)、(3.79±0.93);(13.39±4.49)、(7.61±6.35)、(5.27±2.69)。结论WT可以通过抑制PI3K通?

非清髓异基因造血干细胞移植联合伊马替尼治疗慢性粒细胞白血病的临床研究

目的 探讨非清髓造血干细胞移植联合伊马替尼(格列卫、STI571)在治疗慢性粒细胞白血病(CML)中的作用。方法 10例CML患者中3例为慢性期,4例为加速期,3例为急变期。移植前、后口服格列卫(400～1500mg/d)治疗,预处理方案为福达拉宾,环磷酰胺和阿糖胞苷联合抗胸腺细胞球蛋白或CD3单抗。供者HLA配型4例完全相合,2例1个位点不相合,1例2个位点不相合的同胞,1例3个位点不相合的同胞及2例半匹配的母亲供者。干细胞来源为重组人类粒细胞集落刺激因子(rhG- CSF,格拉诺赛特)动员的外周血造血干细胞(PBSC),移植物抗宿主病(GVHD)的预防以环孢菌素A和霉酚酸酯(骁悉)为主,部分病例加用甲氨蝶呤、CD3单抗及CD25单抗(塞尼派)。结果 10例患者均获得不同程度的嵌合状态,3例获得完全嵌合(>95%),7例获得44%～95%的混合嵌合。7例混合嵌合状态的患者经调整免疫抑制剂、供者淋巴细胞/PBSC输注,格列卫治疗,6例患者在移植后1 5～10个月转变为完全嵌合。移植后中性粒细胞>0. 5×109/L所需天数为16d(10～21d);血小板大于20×109/L所需天数为10d(4～15d)。移植期间1例患者移植后45d因肠道感染,颅内出血死亡。另1例患者移植后27d因多脏器衰竭死亡。8例患者随访7～23个月,6例发生Ⅰ～Ⅱ度GVHD,2例发生Ⅲ～Ⅳ度GVHD,除1例因慢性GVHD死?

LY294002对CML急变期细胞中Wnt/β-catenin信号通路的影响及其效应

β-catenin在慢性粒细胞白血病急变过程中发挥着重要作用,而其受BCR/ABL及其下游信号通路调控的具体分子机制尚未完全阐明。该研究旨在探讨PI3K-AKT信号通路对慢粒急变期细胞的影响及其对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。采用PI3K-AKT信号通路的靶向抑制剂LY294002作用于慢粒急变期K562细胞,MTT法检测其对细胞增殖的影响,甲基纤维素克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力,Western blot检测pAKT(Thr308)的表达变化,RT-PCR和Western blot分别检测β-catenin及其下游靶基因c-myc、cyclinD1的mRNA和蛋白表达情况。结果显示,10,20,40μmol/L的LY294002作用细胞24 h后,抑制了K562细胞的增殖以及克隆形成能力,该效应呈浓度依赖的方式。3种浓度的LY294002处理细胞后,PI3K-AKT信号通路明显被抑制,pAKT(Thr308)的蛋白表达明显减少;β-catenin的mRNA表达无明显改变,但其蛋白水平依次减少;β-catenin的下游靶基因c-myc、cyclinD1的mRNA和蛋白水平均明显降低。综上所述,抑制PI3K-AKT信号通路可抑制白血病K562细胞的增殖和克隆形成能力,其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路相关。