bcr-abl基因检测寡核苷酸芯片的制备及分析

为了研究bcr abl融合基因检测芯片在白血病诊断、分型、治疗方案选择及预后判断中的应用价值 ,设计了融合基因检测探针 ,制成寡核苷酸芯片 ;采用逆转录方法、荧光标记白血病细胞cDNA并进行杂交 ,以检测白血病细胞中bcr abl基因。结果表明 :通过对不同杂交温度、洗涤条件等的探索获得了较好的反应条件并用制备的芯片检测出了细胞株中的bcr abl融合基因。结论 :应用寡核苷酸芯片检测白血病细胞bcr abl融合基因有独特的优势 ,具有一定的临床应用价值 ,但也存在一定的不足 ,若对芯片进一步改进 ,则今后在血液病方面应用前景是非常广阔的。

38例不同病期慢性粒细胞白血病患者bcr-abl基因的表达

目的 探讨慢性粒细胞白血病(CML)不同病期bcr-abl基因的表达。方法 应用RQ-PCR方法检测38例共45份不同临床分期CML病人外周血中bcr-abI的表达水平。结果 CML病人的bcr-abl基因和bcr-abl/abl比率在慢性期分别为(11542±5106)拷贝/μg总RNA和(10.58±5.12)％;加速期分别为(83350±7844)拷贝/μg总RNA和(84.20±3.78)％;急变期分别为(79112±7956)拷贝/μg总RNA和(80.15±4.16)％。bcr-abl基因表达水平与CML不同临床病期密切相关。结论 RQ-PCR检测bcr-abl基因表达可作为CML疾病进展、预后判断和骨髓移植后微小残留疾病监测的良好指标。

应用实时定量RT-PCR检测bcr-abl融合基因的表达

背景与目的:白血病患者经诱导化疗达完全缓解时髓外某些隐蔽处仍残存白血病细胞,这是白血病复发的根源。为了彻底治愈白血病,不仅要及时发现残存的白血病细胞,还要对其进行定量监测,以指导治疗和判断预后。本研究旨在建立检测bcr-abl融合基因的实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)体系,并采用此方法对bcr-abl融合基因进行定量分析。方法:通过RT-PCR扩增K562细胞bcr-abl融合基因,用T-A克隆法构建重组质粒作为标准品。绘制出bcr-abl的标准曲线,并对16例慢性粒细胞白血病患者骨髓标本进行bcr-abl融合基因进行定量。标定RT-PCR反应的敏感性、稳定性和重复性。结果:检测到10个拷贝的重组质粒。重复性及稳定性验证结果表明,Ct值变异系数分别为2.19%和3.21%,标准曲线的回归系数为0.984。16例慢性粒细胞白血病患者bcr-abl融合基因表达量的中位数为4.58×104kb/μgRNA。结论:实时定量RT-PCR具有高敏感性、重复性、特异性和稳定性,可以对bcr-abl融合基因进行定量监测。

定量检测bcr-abl mRNA在慢性粒细胞白血病患者异基因造血干细胞移植后的意义

本研究确切了解CML患者异基因造血干细胞移植后bcr-abl mRNA的变化情况,为临床诊断早期复发提供实验依据。用实时荧光定量PCR方法检测15例慢性粒细胞白血病(CML)患者异基因造血干细胞移植前后78份外周血和骨髓标本的bcr-abl mRNA水平。结果表明,移植前患者的bcr-ablmRNA水平较高,中位数为29.303%;移植后1个月时检测bcr-abl mRNA水平较移植前大幅度降低,中位数为0;移植后1年内,连续多次检测bcr-abl mRNA水平,变化模式不一致,但6个月后的总体水平较6个月前明显降低,移植1年以上的受者绝大多数bcr-abl mRNA检测不到,或偶可检测到,但水平极低(0.007%、0.004%和0.021%),所检测受者的骨髓和外周血像均正常;同期骨髓与外周血bcr-abl水平无明显差异,且变化趋势一致。结论:CML患者移植后早期bcr-abl水平变化起伏较大,连续动态检测可明确其变化趋势,有助于判断移植效果、指导临床治疗,但6个月前检测到bcr-abl存在并不提示疾病复发;检测外周血bcr-abl或许更适于临床上对患者的随访。

稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系的建立

为了建立稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞系,从重组克隆载体pGEMbcr-abl中酶切出bcr-abl融合基因片段,并将其亚克隆进逆转录病毒载体pLXSN中。脂质体介导重组逆转录病毒载体pLXSNbcr-abl转染包装细胞PT67,采用G418筛选后获得稳定产病毒的包装细胞。收集病毒感染NIH/3T3细胞,加G418筛选后进行逆转录病毒滴度的测定,计算病毒效价为2×107CFU/ml。结果表明,收集病毒上清感染SP2/0细胞(H-2d),经G418筛选获得了稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞株。经特异性PCR扩增和RT-PCR反应扩增,从基因组整合和基因表达水平证实获得了能稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系。结论:成功建立了表达bcr-abl融合基因的鼠SP2/0细胞系,这一肿瘤细胞模型可作为研究bcr-abl基因疫苗的有效实验工具,为检验bcr-abl基因疫苗激发小鼠CTL应答的研究奠定物质基础。

慢性髓性白血病bcr-abl融合基因的克隆与表达

以慢性髓性白血病K562细胞总RNA为模板,采用RT PCR技术扩增包含bcr abl融合位点周围的基因片段,定向克隆到pGEX 6P 1载体谷光甘肽S转移酶(GST)的下游。将重组质粒转化大肠杆菌BL21菌株,以1.0mmol·L-1IPTG诱导bcr abl融合基因片段的表达,其产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,结果证实该融合蛋白分子质量约42ku。用该表达产物免疫ICR小鼠,所制备的抗血清可与K562细胞中特异性抗原反应,表明该bcr abl/GST融合蛋白具有bcr abl基因产物的特异抗原性。

异基因造血干细胞移植后慢性粒细胞白血病患者bcr-abl融合基因水平的动态变化

背景:bcr-abl融合基因不仅是慢性粒细胞白血病的诊断标准,其水平的变化也是判断病情或疗效的惟一指标,尤其是bcr-abl融合基因的动态变化对于异基因造血干细胞移植效果的评估和预后判断可能更为重要。目的:了解慢性粒细胞白血病患者异基因造血干细胞移植后bcr-abl融合基因水平的变化情况。设计:回顾性病例分析。对象:2001-04/2007-01在广东省人民医院血液科收治的确诊1年内行异基因造血干细胞移植的慢性粒细胞白血病患者22例,中位年龄31.5岁,患者对治疗均签署知情同意书,治疗方案经医院医学伦理委员会批准。方法:所有同胞供者均采用粒细胞集落刺激因子行外周血干细胞动员。所有患者均采用改良BU/CY联合FLU预处理方案,供受者血型不相合者于移植前7d、1d行血浆置换以降低血型抗体滴度。患者经深静脉输入同胞供者平均单个核细胞数为5.48×108/kg,平均CD34+细胞数为10.45×106/kg。由于移植和随访时间不同,每例患者收集标本3～14份,共130份外周血标本。主要观察指标:通过实时荧光定量PCR法检测22例患者异基因造血干细胞移植后不同时间130份外周血标本中bcr-abl融合基因的水平。结果:移植后6个月内,bcr-abl融合基因总体水平逐渐降低,移植后1、3、6个月bcr-abl阴性患者的比例分别为33.33%、53.33%和84.62%,bcr-abl高水平阳性(bcr-abl/abl≥0.02%)患者的比例分别为58.33%、33.33%和15.38%,低水平阳性(bcr-abl/abl<0.02%)患者的比例分别为8.33%、13.33%和0。移植6个月后,多数患者连续多次检测不到bcr-abl融合基因,其中持续阴性者9例(69.23%),低水平波动者1例(7.69%),低水平持续阳性者1例(7.69%),复发2例(15.38%);复发的2例患者移植后6个月内连续检测bcr-abl融合基因水平均未降低至0,且3次检测结果中2次属于高水平阳性。结论:异基因造血干细胞移植后,慢性粒细胞白血病患者bcr-abl融合基因总体水平逐渐下降,但不同患者bcr-abl变化情况各异,通过实时定量PCR检测可明确其变化趋势。

筑巢式PCR检测慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因

目的探讨最适退火温度和核酸扩增（PCR）周期，利用筑巢式PCR检测慢性粒细胞白血病（CML）的bcr-abl融合基因类型，并进行PCR荧光定量（RQ—PCR），研究其与疾病的关系。方法通过改变PCR条件，将退火温度由55℃增加到60℃，反应周期由原来的30周期增加到45周期，检测14例22份标本。同时用荧光定量试剂检测标本。结果退火温度为58℃，45周期可测出10^3 copies／μl定量标准品的PCR产物。22份标本6cr-abl融合基因巢式PCR结果均阳性。其中b2a2型9份，b3a2型13份。定量检测18例阳性，量值在10^2-10^6copies／μg，两例急变患者急性期和慢性期有明显差异。结论筑巢式PCR是一种敏感而准确的检测方法，对bcr—abl进行定量有助于反映白血病细胞负荷、评价疗效及判断疾病预后。

bcr-abl融合基因在慢性粒细胞白血病诊治中的意义

目的探讨定量检测bcr-abl融合基因在慢性粒细胞白血病(CML)诊断、治疗及微小残留病变监测中的意义。方法应用实时定量PCR(RQ-PCR)方法检测145例CML患者bcr-abl融合基因的表达情况。结果abl和bcr-abl的标准曲线相关系数均大于0.99,批内差及批间差均小于4%;11例不同分期的CML患者同时检测外周血和骨髓中bcr-abl水平,8例外周血较骨髓低,3例较骨髓高;急变期的bcr-abl表达情况较加速期和慢性期均明显增高。结论RQ-PCR技术检测bcr-abl融合基因准确可靠,对于评价疗效、监测微小残留病变以及预测疾病进展具有重要的临床应用价值。

RNA特异性干扰bcr-abl融合基因联合p27基因克隆对K562细胞的影响

本研究旨在探讨RNA干扰抑制慢性髓系白血病bcr-abl融合基因表达,以及RNAi和p27基因克隆联合作用对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。以细胞系K562为研究对象,合成并转染针对K562细胞bcr-abl融合基因融合位点的21nt siRNA,应用Northern blot法检测bcr-abl融合基因的表达,Western blot法检测BCR-ABL蛋白及凋亡相关蛋白BCL-xL的表达;同时应用RT-PCR扩增p27基因,构建P27-pcDNA3.1载体,转染p27基因入缺失p27基因的K562细胞,经筛选得到G418抗性的K562细胞株;经Western blot证实有P27蛋白表达后,联合应用RNA干扰及p27基因克隆,通过MTT法及流式细胞仪等检测联合作用后对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。结果表明,RNA干扰组K562细胞bcr-abl融合基因的表达水平明显下降,转染24小时时有18.4%的K562细胞发生凋亡,细胞凋亡相关蛋白BCL-xL的表达水平下调,出现明显的G1期阻滞;表达外源性P27蛋白的P27-pcDNA3.1-K562细胞株生长速度明显慢于对照K562细胞株。流式细胞仪检测显示,G0/G1期细胞增多,S期细胞明显减少;RNA干扰与p27基因克隆联合作用于K562细胞后,凋亡细胞比例明显上升(33.4%)。MTT法显示,细胞存活率较单纯p27-K562细胞组及RNA干扰-K562细胞组均明显下降(p<0.01和p<0.05)。结论:特异性siRNA分子可以抑制bcr-abl融合基因的表达,诱导K562细胞分化或凋亡。RNA干扰联合p27基因克隆对抑制K562细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用。

慢性粒细胞白血病异基因造血干细胞移植后bcr—abl动态监测对低复发患者筛选的意义

目的寻找慢性粒细胞白血病（CML）患者异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后早期bcr-abl的动态变化规律，以识别不需要干预的低复发患者。方法2004年11月至2006年11月在我院接受allo-HSCT的CML患者149例。移植前后采用实时定量PCR方法定期监测骨髓bcr—abl转录本的水平，计算未干预组患者各时间点的bcr—abl中位值，并采用Mann-Whitney U比较同一时间点不同移植模式下的bcr—abl水平。采用Kaplan—Meier曲线计算复发率、生存率和移植物抗宿主病（GVHD）发生率。结果149例患者2年总生存率为86．0％（CI：82．9％-89．1％），累积血液学复发率为3．5％（CI：1．7％～5．3％）。未干预组患者102例，bcr—abl水平中位值：移植前25．800％（0．067％-96．100％），＋1个月0．025％（0～3．583％），＋2个月0．011％（0～0．425％），＋3个月0．002％（0—0．610％），＋4个月为0（0—0．056％）。本组患者至随访结束无一例复发。未干预组患者HLA配型不合组、配型相合组和非血缘关系移植组分别于移植后3、4和5个月bcr—abl下降至不能检测出其水平。结论CML患者allo—HSCT后bcr—abl的动态监测有助于筛选出无须干预的CML患者。

桂皮醛体外诱导慢性髓系白血病细胞凋亡的机理研究

本研究探讨桂皮醛(cinnamic aldehyde,CA)对慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)细胞的诱导凋亡作用及其机制。以不同浓度的桂皮醛作用于体外培养的K562细胞和骨髓CML原代细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率,Real-time PCR技术检测K562细胞BCR-ABL融合基因表达变化,免疫印迹法检测K562细胞CrkL磷酸化水平和C-MYC蛋白表达。结果表明:桂皮醛可诱导K562和骨髓CML原代细胞凋亡。在K562细胞凋亡过程中,BCR-ABL融合基因mRNA的表达、CrkL蛋白磷酸化及C-MYC蛋白表达均明显受抑。结论 :桂皮醛体外诱导CML细胞凋亡,其机制与BCR-ABL融合基因表达和功能受抑有关。

格列卫治疗慢性粒细胞白血病各期疗效观察

目的：比较伊马替尼（格列卫）在慢性粒细胞白血病（CML）慢性期、加速期及急变期的治疗疗效，探讨相关影响因素。方法：CML慢性期28例、加速期8例及急变期6例患者口服格列卫，观察血液学、细胞遗传学及分子学疗效，评估总生存率及疾病进展情况，观察药物副作用并分析相关影响因素。结果：①慢粒慢性期完全血液学缓解率、完全细胞遗传学缓解率、完全分子学缓解率分别为100%、82.1%和21.4%。预计5年总生存率（OS）、无疾病进展生存率（ PFS）分别为96.4%、85.7%，均明显高于加速期及急变期患者（ P＜0.001）。②CML慢性期严重血细胞减少明显少于加速期及急变期（ P＜0.001），副作用少见。③停药时间长及治疗前应用干扰素等治疗是影响格列卫治疗CML疗效的不利因素。结论：CML早期应用格列卫疗效好、安全性好，格列卫作为CML一线治疗药物值得推广。

5例Ph染色体阳性的急性白血病临床和实验室分析

目的了解Ph染色体阳性(Ph+)急性白血病(AL)的临床特点及预后。方法对75例AL患者,采用骨髓细胞直接法或短期培养法制备染色体,经常规细胞遗传学检查确诊5例Ph+的AL,并对其进行荧光原位杂交研究,观察其临床特点、实验室改变和预后。结果Ph+AL占同期AL的6·7%。5例Ph+中急性淋巴细胞白血病4例,急性髓细胞白血病1例;3例为单纯t(9;22),bcr-abl融合基因均阳性;2例同时出现其它的染色体异常,其中1例为少见的继发性Ph+;4例外周血WBC>100×109/L。5例中3例获完全缓解,但又于半年内复发,5例均在1年内死亡,中位生存期为4.6个月。结论Ph+AL具有独特的临床、血液学和预后特点,是一种预后不良的细胞遗传学改变。

慢性髓细胞白血病的细胞遗传学和荧光原位杂交分析

目的 探讨慢性髓细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）细胞遗传学、分子遗传学特点及其临床意义.方法 选择196例CML患者,采用直接法和（或）24 h短期培养法制备骨髓染色体标本,采用R显带技术（RHG）进行染色体核型分析;用BCR-ABL双色双融合探针或ES探针对骨髓间期细胞进行荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）检测.结果 将患者分为慢性期和加速/急变期2组.细胞遗传学分析：附加染色体异常、变异易位在2组中比例分别为9/166（5.4%）、7/166（4.2%）和19/30（63.3%）、3/30（10.0%）.196例患者中检出179例Ph阳性标本,占91.3%;其中典型易位169例（94.4%）,变异易位10例（5.6%）,附加染色体异常出现频率最多的为双Ph、＋ 8、I（17q）、-Y.分子遗传学分析：68例患者行FISH 检测,均为BCR-ABL融合基因阳性（含10例变异易位、11例Ph染色体阴性及6例染色体检测失败者）,其中10例（14.7%）为der（9）缺失（含1例染色体检测失败者）,在慢性期、加速/急变期中比例分别为8/55（14.5%）、2/13（15.4%）.68例患者中典型易位41例,变异易位10例,der（9）缺失在典型易位、变异易位中比例分别为5/41（12.2%）和4/10（40.0%）.结论 与慢性期相比,加速/急变期附加染色体、变异易位等异常明显增加,染色体核型分析有助于疾病诊断和进展的分析,并且在遗传学分析的基础上,选用分子遗传学FISH技术可以明显提高疾病的诊断率和染色体异常的检出率及准确率,并可有效检测der（9）缺失.

应用不同技术检测白血病患者融合基因的比较

慢性粒细胞白血病（chronicmyeloidleukemia，CML）是一种起源于造血干细胞的恶性血液病，是迄今发现的第一种与染色体异常直接相关的人类恶性肿瘤。CML患者具有特征性的Ph染色体，该染色体是9号和22号染色体相互易位形成的，其形成的BCR—ABL融合基因编码产生的Bcr-Ab1融合蛋白与正常ab1蛋白相比，具有较强的酪氨酸激酶活性，从而促进细胞分裂、降低细胞对凋亡信号的反应、延长细胞存活，导致白血病的发生。

仅以血小板增多为首发表现的慢性粒细胞白血病5例临床分析

目的:探讨仅以血小板增多为首发而没有典型慢性粒细胞白血病(CML)表现的5例患者的临床诊断及治疗效果。方法:回顾性分析5例仅以血小板增多为首发表现的CML患者的临床资料。结果:5例患者均仅以血小板增多为首发表现,均无肝脾肿大;血小板均>1 000×109/L,白细胞计数及分类正常;骨髓细胞学示巨核细胞明显增多,粒系增生正常,NAP积分正常或增加;患者均有Ph染色体和BCR-ABL融合基因;患者均使用伊马替尼治疗,4例在12个月内达到完全分子学反应。结论:仅以血小板增多为首发表现的患者,如缺乏典型CML的临床表现,易误诊为原发性血小板增多症,应作Ph染色体及BCR-ABL融合基因检测以鉴别;这些患者给予伊马替尼治疗取得很好的疗效,可能是CML的发病早期。