表达大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)腺相关病毒的构建及体外表达分析

目的构建携带大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因的重组腺相关病毒(AAV)载体,并检测体外表达目的基因的能力。方法应用基因克隆技术将大鼠BDNF的cDNA基因序列克隆入腺病毒质粒pAAV-MCS,PCR酶切测序鉴定序列。与AAV病毒包装质粒pAAV-RC、pHelper用磷酸钙法共转染HEK293细胞,包装得到含转基因过表达BDNF的病毒载体(rAAV-BDNF)。重组病毒感染体外培养的Hela细胞后,用RT-PCR和Western Blot方法检测细胞BDNF基因及蛋白表达情况,用ELISA法测定培养液中表达产物浓度。结果证实BDNFcDNA片段插入到病毒基因组内,并整合到宿主基因组后稳定表达,病毒滴度可以达到1.29×108PFU/mL。重组病毒感染Hela细胞后能高水平表达BDNF,ELISA结果表明,Hela细胞从病毒感染后第2天到第10天表达BDNF水平呈上升趋势,第10天达到2253pg/mL。结论成功地构建了表达BDNF基因的腺相关病毒载体,并可在体外高水平表达其所携带的目的基因,为将其进一步应用于神经系统损伤性疾病治疗的研究奠定了方法学基础。

表达大鼠脑源性神经营养因子腺相关病毒(rAAV-BDNF)对体外培养海马神经元保护作用的研究

目的:研究表达大鼠脑源性神经营养因子腺相关病毒(rAAV-BDNF)对体外培养海马神经元的保护机制。方法:通过去血清培养诱导神经元凋亡后转染rAAV-BDNF,通过DAPI、PI及Actin染色来统计rAAV-BDNF对血清饥饿引起的细胞凋亡的数量及形态的影响。结果:rAAV-BDNF病毒能够有效地抑制血清饥饿引起的细胞凋亡,其保护效率在65左右,并可以有效地保护血清饥饿引起的细胞形态损伤。结论:rAAV-BDNF可通过抑制凋亡的途径保护体外培养的海马神经元。

携带大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因重组慢病毒载体的构建及体外表达检测

目的构建携带大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因重组慢病毒载体,并检测其体外表达目的基因的能力。方法应用基因克隆技术将大鼠BDNF基因克隆入慢病毒载体pFUW中,经过PCR、酶切和测序鉴定后,与包装质粒共转染293T细胞,制备并收集携带BDNF基因的慢病毒,重组病毒感染体外培养Hela细胞,利用实时定量PCR、蛋白质免疫印迹方法检测BDNF的表达情况,观察病毒转染效果。结果PCR、酶切和测序鉴定,成功克隆了pFUW-BDNF重组子。所包装的重组慢病毒对Hela细胞的感染效率>90%,实时定量PCR、蛋白质免疫印迹方法可以检测到重组慢病毒感染Hela细胞后能高水平表达BDNF。结论成功构建了携带BDNF基因慢重组病毒载体,并可在体外高水平表达其所携带的目的基因,为将其进一步应用于神经系统损伤性疾病的治疗研究奠定了方法学基础。

腺病毒介导的BDNF基因脊髓内转移对神经根损伤后神经元内酶的影响

目的 观察神经根损伤后进行BDNF基因治疗对神经元的保护作用。方法 在神经根缝合基础上 ,通过无创注射将复制缺陷重组腺病毒载体直接转移至大鼠神经根损伤部相应的脊髓腹角。分别于术后 1、3、7、14、2 8d比色法测定AChE和ACP酶活性的变化。结果 AXCA BDNF组伤后AChE活性高于损伤组 ,而ACP活性均低于损伤组。AXCA BD NF能够降低酶的变化幅度。结论 神经根重建结合BDNF基因治疗可明显减轻神经元的损伤程度 。

表达分泌型脑源性神经营养因子的腺相关病毒载体的构建及其表达的检测

采用PCR和体外连接的方法构建了带有信号肽的脑源性神经营养因子(BDNF)的融合基因,将此基因插入到腺相关病毒载体穿梭质粒pSNAV,然后用重组质粒pSNAV-Ig-BDNF转染包装细胞,筛选出永久细胞株后,用携带腺相关病毒rep及cap基因的单纯疱疹病毒超感染包装细胞,成功包装出含有目的基因的一型血清型腺相关病毒。经PCR鉴定该病毒含有目的基因片段,被该病毒感染的细胞裂解液经Western blotting证实有BDNF表达,其培养液经ELISA检测证实含有高水平的BDNF蛋白。该病毒与小量的非复制型腺病毒Ad-null联合应用时,其BDNF蛋白的表达水平显著提高。可弥补腺相关病毒起效慢、对细胞转导效率低的弱点,为今后应用AAV作基因治疗提供了实验证据。

脑源性神经营养因子研究现状

近年来神经科学的研究表明 ,神经营养因子是选择性调节周围神经和中枢神经系统神经生长和存活的一类蛋白质。脑源性神经营养因子 (brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)是神经生长因子 (nervegrowthfactor,NGF)发现后约 30年由德国神经生物学家Barde[1] 报告的另一神经营养因子 ,它对CNS多种类型神经元的生长、发育、分化、维持和损伤修复都具有重要作用 ,对神经系统疾病诸如早老性痴呆、帕金森氏病和肌萎缩侧索硬化等退变性疾病的治疗具有潜在应用前景。本文就脑源性神经营养因子的结构、功能及应用前景作一综述。

大鼠海马脑区脑源性神经营养因子慢病毒注射与表达的检测

目的:建立成年大鼠海马脑区注射脑源性神经营养因子(BDNF)慢病毒表达载体的方法,并检测BDNF慢病毒载体体内表达目的基因的能力。方法:健康雄性SD大鼠随机分为假手术组(SH)、生理盐水组(NS)、GFP慢病毒注射组(GFP)和BDNF慢病毒注射组(BDNF),每组15只。所有实验大鼠在脑立体定位仪下定位海马组织。NS、GFP和BDNF组分别给予盐水(2μL)、GFP慢病毒(2μL)和BDNF慢病毒(2μL),SH组只实行手术操作。注射手术7d、14d和30d后,分别处死大鼠并进行在冰上取各组大鼠海马组织,分别提取海马总RNA和总蛋白质通过RT-PCR和Western blot检测各组大鼠海马组织BDNF mRNA和蛋白表达水平的变化。同时通过原位杂交方法检测BDNF的表达水平和脑区分布。结果:BDNF慢病毒注射成年大鼠7d、14d和30d后,均可以成功检测到BDNF在mRNA和蛋白水平在海马脑区都有明显的表达,同假手术组相比具有显著性差异;原位杂交检测显示BDNF慢病毒注射成年大鼠海马脑区7d、14d和30d的BDNF表达水平和脑区分布均保持稳定。结论:成功地建立了BDNF慢病毒注射成年大鼠海马脑区的方法,并可在注射后不同时间段检测到BDNF高水平的表达和均匀的海马脑区分布,为进一步将其应用于神经系统损伤性疾病的治疗奠定了基础。

脑源性神经营养因子基因治疗对大鼠脑内多巴胺含量的影响

采用脑源性神经营养因子（BDNF）基因工程成肌细胞纹状体内移植观察其对帕金森病（PD）大鼠脑内纹状体多巴胺含量的影响，结果发现：基因工程成肌细胞脑内移植可使纹状体多巴胺含量明显增加，并可维持达两月之久，这为帕金森病的治疗提供了一种新的有效的治疗方法。

腺病毒介导的脑源性神经营养因子基因治疗大鼠神经根损伤

目的:观察腺病毒介导的脑源性神经营养因子(BDNF)基因脊髓内转移对神经根损伤后的治疗效果。方法:制作大鼠神经根切断吻合模型,分为两组:治疗组通过显微注射法在立体定位仪上将2μl重组腺病毒BDNF载体(AxCA-BDNF)直接注入大鼠神经根损伤部相应的脊髓腹角;损伤组注射病毒缓冲液。术后观察霍乱毒素-辣根过氧化物酶(CT-HRP)逆行标记的神经元数目及坐骨神经功能指数(SFI)的改变。结果:与损伤组比较,治疗组神经根伤后CT-HRP标记神经元的数目明显增加,坐骨神经功能指数(SFI)的恢复率明显升高。结论:AxCA-BDNF基因治疗对大鼠脊髓水平的神经根修复是一种有效的方法。

重组大鼠脑源性神经营养因子腺病毒的构建及体外表达分析

目的构建含有大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因的重组腺病毒(AD)载体,并分析其体外表达情况。方法将采用RT-PCR技术获取的大鼠BDNF的cDNA基因定向克隆入穿梭质粒pAdTrack-CMV中。通过与腺病毒骨架载体pAdeasy-1在细菌内同源重组形成重组腺病毒质粒pAd-BDNF,转染人胚肾293细胞后包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒(Ad-BDNF)。重组病毒感染体外培养的Hela细胞后,用RT-PCR、Western blot及免疫细胞化学检测细胞BDNF基因及蛋白表达情况。结果 pAd-BDNF测序结果和预期一致,同源重组并经293细胞包装后形成重组腺病毒Ad-BDNF,重组病毒感染Hela细胞后能高水平表达BDNF。结论成功制备了重组腺病毒Ad-BDNF,感染细胞证实其呈分泌表达,为将其进一步应用于神经系统损伤性疾病治疗的研究打下了基础。

脑源性神经营养因子基因修饰神经干细胞对体外培养的脊髓背根神经节细胞的生物学作用

目的建立稳定表达脑源性神经营养因子(BDNF)基因的神经干细胞并观察其对于体外培养的脊髓背根神经节(DRG)细胞存活及突起生长的影响。方法以PCR技术从人脑cDNA文库中获取人BDNF基因片段。采用分子克隆技术构建带有绿色荧光蛋白报告基因的多顺反子的MSCVBDNFIRES2EGFP重组鼠干细胞病毒表达载体,病毒经PT67细胞包装后感染神经干细胞株C17.2。通过免疫组化,RTPCR,ELISA检测BDNF的表达,在双室共培养系统中共培养3,10d后观察经筛选的稳定表达株对原代培养DRG细胞的生物学作用。结果RTPCR证实BDNF基因在C17.2细胞中转录,ELISA分析显示转基因C17.2培养上清中在转染24h后即可检测到BDNF表达,并在3个月后仍表达(14.6±0.8)ng·d-1·10-1细胞;免疫细胞化学显示,与对照组相比较,BDNF基因修饰的神经干细胞组,DRG细胞突起生长较长交织呈网状的,节细胞存活较多。结论干细胞病毒介导转染的BDNF基因能够在神经干细胞C17.2中稳定表达,并且BDNF基因修饰的神经干细胞对体外培养的DRG细胞的存活及突起、延伸具有显著促进作用。

腺病毒介导脑源性神经营养因子基因转移对神经根损伤后再生相关基因的影响

目的观察腺病毒介导的脑源性神经营养因子(BDNF)基因脊髓内转移对神经根损伤后再生相关基因表达的影响。方法在大鼠神经根切断吻合模型基础上,通过显微注射法在立体定位仪上将2μl复制缺陷型重组腺病毒载体(AxCA-BDNF)直接注入大鼠神经根损伤部相应的脊髓腹角。损伤组注射病毒缓冲液2μl。术后1、3、7、14、28d,利用免疫组化、原位杂交,观察β管蛋白和GAP-43mRNA表达的改变。结果与损伤组比较,注射AxCA-BDNF组动物β微管蛋白和GAP-43 mRNA表达在术后3、7、14、28d间差异有统计学意义(P＜0．05)。结论AxCA-BDNF治疗能促进神经根损伤后神经元β管蛋白的合成,促进轴突的延伸；同时发现AxCA-BDNF治疗,能上调GAP-43表达,增加损伤神经元发芽的潜能。