基于代谢组学方法研究生半夏和姜半夏对BeWo细胞的毒性机制

目的通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术分析生半夏和姜半夏干预后细胞内代谢物改变,来评价生半夏和姜半夏潜在的发育毒性。方法采用胎盘组织来源的BeWo细胞系构建体外胎盘模型,运用GC-MS检测细胞经生半夏及姜半夏干预后细胞内所含代谢物及其相对含量的变化。结果细胞代谢物中共鉴定出甘氨酸、氨基丙二酸、脯氨酸、葡萄糖、半乳糖、硬脂酸在、肌醇等九种差异性代谢物。结论运用GC-MS代谢组学技术评价半夏及姜半夏的发育毒性具有可行性。

乙型肝炎病毒感染人胎盘绒毛膜癌BeWo细胞体外培养模型的建立

目的建立乙型肝炎病毒(HBV)感染人绒毛膜癌滋养层细胞(BeWo)体外培养模型,探讨HBV宫内感染机制。方法应用高病毒载量的HBV阳性血清感染BeWo细胞并传代,应用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测感染初代细胞和传代细胞内以及上清液中HBV DNA量;应用化学发光微粒子免疫法检测感染后初代细胞和传代细胞的上清液中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)量;应用SABC免疫组化检测感染细胞内HBsAg、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)的表达。结果感染初代各时间点细胞内和上清液中HBVDNA量随时间延长而增加,120 h HBV DNA量最高;传代细胞内和上清液中HBV DNA量随传代次数增加逐渐降低,5代后检测均为阴性。感染初代各时间点细胞的上清液中HBsAg量随时间延长而增加;传代细胞的上清液中HBsAg量在1～3代为阳性,但量逐渐降低,4代后均为阴性。感染初代各时间点细胞和传代细胞的上清液中HBeAg量均为阴性;1～3代细胞HBsAg、HBcAg染色可见阳性细胞。结论 HBV可以感染BeWo细胞,且能在传代细胞中表达;BeWo细胞可用于HBV宫内感染机制的研究。

HBeAg真核表达载体的构建及其在Bewo细胞中的表达

目的构建乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBe,并观察其在Bewo细胞中的表达。方法用PCR方法从质粒pMD18T-HBV中扩增HBeAg基因,克隆到pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBe,通过酶切、PCR及测序鉴定,并将该载体转染Bewo细胞,72h后,用Western免疫印迹和微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测HBeAg蛋白在胞内和上清中的表达。结果通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建HBeAg表达载体,该载体可以在Bewo细胞系中表达HBeAg,并可分泌HBeAg。结论构建了HBeAg真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBe,为研究胞内HBeAg对Bewo细胞Toll样受体表达的作用奠定了基础。

14-3-3tau蛋白通过ERK信号通路调控BeWo细胞的侵袭功能

目的:探讨14-3-3tau蛋白对滋养细胞侵袭功能的影响及可能机制。方法:免疫组化法检测人早孕期绒毛、蜕膜以及人绒癌滋养细胞株BeWo中14-3-3tau的表达。RNA干扰方法下调BeWo细胞14-3-3tau的表达,RT-PCR和Western blotting方法检测E钙黏附素及转录因子snail的表达变化,Transwell小室方法检测侵袭细胞数目的变化。用U0126特异性阻断胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)信号通路,观察下调14-3-3tau对BeWo细胞侵袭能力的变化。结果:(1)14-3-3tau在早孕期绒毛外细胞滋养细胞和侵袭入蜕膜组织的游离型滋养细胞以及BeWo细胞中均有表达。(2)下调BeWo细胞14-3-3tau表达后,E钙黏附素表达下降,Snail表达增加,穿过Transwell小室的细胞数增加(P<0.05)。(3)U0126阻断14-3-3tau下调引起的BeWo细胞侵袭增加(P<0.05)。结论:14-3-3tau通过ERK1/2信号通路抑制滋养细胞的侵袭能力。

不同缺氧方法诱导BeWo细胞缺氧诱导因子 1α表达的实验研究

【目的】探讨用于滋养细胞缺氧研究的缺氧方法及滋养细胞模型。【方法】滋养细胞来源的BeWo细胞系,分4组培养:正常对照组、低氧浓度组、二氯化钴组和去铁敏组。培养4 8h后收集细胞,应用实时定量PCR方法,检测BeWo细胞HIF- 1αmRNA表达水平;应用Westernblot方法,检测BeWo细胞HIF -1α蛋白的表达水平。【结果】与正常对照组相比,低氧浓度组、二氯化钴组和去铁敏组的HIF- 1α蛋白和mRNA表达均明显升高;与低氧浓度组比较,二氯化钴组和去铁敏组HIF 1α蛋白和mRNA表达水平无明显差异。【结论】环境缺氧和细胞缺氧均可诱导BeWo细胞HIF 1α的表达,二氯化钴或去铁敏可以作为缺氧方法用于滋养细胞缺氧方面的研究,BeWo细胞也可作为一种细胞模型用于HIF -1α表达的研究。

缺氧对BeWo细胞系中缺氧诱导因子2及其靶基因VEGF表达的影响

目的:探讨缺氧对体外培养的BeWo细胞中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,以及应用反义寡核甘酸封闭缺氧诱导因子2α(HIF- 2α)后,VEGF表达的变化。方法:将BeWo细胞分4组进行体外培养:常氧组、缺氧组、HIF -2α正义组和HIF- 2α反义组。检测HIF- 2α蛋白、HIF -2αmRNA和VEGFmRNA表达。结果:与常氧组相比,缺氧组的HIF- 2α蛋白、mRNA、VEGF的mRNA水平均升高;与缺氧组相比,反义组的HIF -2α蛋白、HIF-2αmRNA、VEGFmRNA表达均降低。结论:缺氧可诱导BeWo细胞中VEGF的表达,这种作用可能是通过HIF-

土贝母皂苷甲作用线粒体途径促进人绒毛膜癌Bewo细胞凋亡

为了研究土贝母苷甲(TBMS1)诱导人绒毛膜癌Bewo细胞凋亡的作用及机制,分别采用MTT法检测细胞增殖的抑制作用,流式细胞术测定药物对细胞周期、凋亡及线粒体跨膜电位(△Ψm)的影响,DNA琼脂糖凝胶电泳分析DNA含量变化和DNA断裂的情况,蛋白质免疫印迹法及RT-PCR法检测细胞凋亡相关基因表达的变化。研究结果显示,TBMS1呈浓度依赖性显著抑制Bewo细胞的生长;流式细胞术分析显示TBMS1能促进细胞凋亡,将细胞周期阻滞在G1期,并导致线粒体跨膜电位降低,细胞色素c(Cyt c)释放,caspase-3表达增强;DNA梯状区带验证了药物诱导细胞凋亡的发生;Bax表达上调,Bcl-2及磷酸化的p38表达下调等结果表明,TBMS1可能是通过p38/MAPK信号通路调控作用,导致线粒体功能紊乱,从而影响凋亡相关基因表达,有效诱导Bewo细胞凋亡。

低氧对BeWo细胞骨桥蛋白表达的影响

目的体外模拟子痫前期胎盘缺氧的低氧环境培养滋养细胞,研究低氧对滋养细胞骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达的影响,以进一步深入研究OPN在子痫前期发病机制中的作用。方法利用气体混配缺氧装置(QT-MTX-3)模拟子痫前期的发生发展过程,配置不同氧浓度,采用细胞免疫组化和实时荧光定量PCR检测人胎盘绒毛膜癌滋养细胞系BeWo细胞在不同氧浓度下OPN蛋白及其mRNA的表达。结果①在不同氧浓度的环境下,显微镜观察BeWo细胞的生长情况,发现其对低氧反应敏感,细胞形态发生明显的改变。②细胞免疫组化检测结果显示:OPN在各组BeWo细胞中均有表达,其免疫反应产物主要表达定位于胞质和胞膜中;缺氧24h各组的OPN蛋白表达无明显变化;但低氧48h后,低氧组OPN蛋白的表达水平均明显下降,且2%O2组OPN蛋白下降更显著。③实时荧光定量PCR检测结果表明低氧对滋养细胞OPN mRNA的表达影响呈现出浓度时间依赖性,即随着氧浓度的降低和低氧时间的延长,OPN mRNA的表达呈显著下降趋势。结论低氧使BeWo细胞OPN的表达降低,且呈浓度时间依赖性,类似于OPN在子痫前期胎盘组织的表达随病情加重而进一步降低,这可能是子痫前期胎盘中缺氧对滋养细胞功能影响的重要机制之一。

单核细胞增生李斯特菌感染对Bewo细胞炎症因子及迁移能力的影响

目的研究单核细胞增生李斯特菌(Lm)感染致Bewo细胞炎症因子表达及迁移能力的变化,并探讨其可能的机制。方法Lm以MOI=10感染Bewo细胞,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Bewo细胞炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的mRNA水平;划痕试验及Transwell试验检测Bewo细胞的迁移能力;Western Blot检测Bewo细胞迁移相关蛋白(MMP2,MMP9,TIMP-1)以及MAPK家族蛋白(p-p38MAPK,p38MAPK,p-ERK1/2,ERK1/2)的表达水平。结果Lm感染Bewo细胞后炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的mRNA水平与感染1 h相比均升高。Western Blot结果表明,随着感染时间的延长,迁移相关蛋白MMP2逐渐升高;MMP9和TIMP-1变化趋势一致,先上升后下降;Lm感染致MAPK家族p38MAPK及ERK1/2蛋白磷酸化水平升高。结论Lm感染Bewo细胞后导致细胞迁移能力增强,MMP2在调控细胞迁移能力的变化中起主要作用,Lm感染可以激活Bewo细胞MAPK家族p38MAPK及ERK1/2信号通路。

AngⅡ对体外培养绒癌BeWo细胞株分泌sFlt-1蛋白的影响

目的进一步探讨肾素—血管紧张素系统(RAS)在子痫前期发病中的作用及机制。方法将体外培养的绒癌BeWo细胞株随机分为四组,其中A组加入95%hamF-12培养液,B、C、D组分别加入血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、缬沙坦及AngⅡ+缬沙坦,培养72 h后收集培养基上清液,用ELISA法检测可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)蛋白表达情况。结果A、B、C、D组血清sFlt-1蛋白分别为(245.76±26.09)、(365.56±30.55)、(259.31±15.42)、(268.53±23.79)pg/ml,B组显著高于其他三组(P均<0.05)。结论RAS激活在子痫前期发病中具有重要作用,上调sFlt-1蛋白水平可能为机制之一;此为临床防治有关母婴并发症提供了理论依据。

人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达

背景:近年来间充质干细胞已是新药开发领域的研究热点,其旁分泌效应也已应用于多种组织损伤性细胞模型修复评估实验,但目前尚无研究探索其条件培养液是否对缺氧状态下人胎盘滋养层系细胞的紧密连接功能具有修复作用。目的:探讨人胎盘源间充质干细胞条件培养液对缺氧条件下人胎盘绒毛膜癌滋养层系BeWo细胞活力和紧密连接因子表达的影响。方法:采用1000μmol/L氯化钴处理12 h诱导BeWo细胞以构建胎盘屏障缺氧模型,检测细胞活力以及缺氧诱导因子1α和紧密连接因子闭合小环蛋白1、封闭蛋白4、封闭蛋白8的表达量变化;在缺氧模型中添加人胎盘源间充质干细胞条件培养液建立缺氧干预组、复氧修复组,检测细胞活力和上述4个基因的表达量改变;为探讨人胎盘源间充质干细胞条件培养液改变闭合小环蛋白1表达量的潜在机制,建立胰岛素样生长因子1缺氧干预组、胰岛素样生长因子1处理组,检测BeWo细胞活力以及闭合小环蛋白1表达量。结果与结论:①氯化钴诱导缺氧显著下调BeWo细胞活力,上调缺氧诱导因子1αmRNA和蛋白表达,下调闭合小环蛋白1和封闭蛋白4 mRNA和蛋白表达,上调封闭蛋白8 mRNA表达,但其蛋白表达下降;②人胎盘源间充质干细胞条件培养液明显提升缺氧条件下BeWo细胞活力和闭合小环蛋白1的表达,下调缺氧诱导因子1α的表达,但对封闭蛋白4无作用;③胰岛素样生长因子1干预缓解了缺氧对BeWo细胞活力的抑制作用,并上调闭合小环蛋白1的表达。

1.3倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及其在Bewo细胞中的表达

目的构建1.3倍乙型肝炎病毒(HBV)全基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBV1.3,并观察其在Bewo细胞中的表达。方法以质粒pMD18T-HBV上的HBV DNA序列为模板,构建1.3倍HBV全基因序列,将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),用酶切、PCR及测序鉴定,并把该载体转染Bewo细胞,以Western免疫印迹、微粒子酶免疫分析法(MEIA)和荧光定量PCR法分别检测胞内和上清中HBsAg、HBeAg蛋白的表达及HBV DNA水平。结果通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建1.3倍HBV全基因表达载体,该载体可以在Bewo细胞系中表达和分泌HBsAg与HBeAg,并可检测到高水平的HBV DNA。结论成功构建了1.3倍HBV全基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBV1.3,为研究胞内HBV宫内感染奠定了基础。

BeWo细胞模型及其在胎盘转运机制研究中的应用

妊娠期胎盘屏障调控了母儿间的物质交换,研究药物的胎盘转运机制对解析药物有效性、安全性和毒性具有重要意义。BeWo细胞来源于人绒毛膜癌细胞,可形成滋养层单层细胞,是有效评价营养物质和药物摄取、外排和转运的胎盘屏障体外模型,该文详细介绍了BeWo细胞模型的特点和建立方法,以及应用该模型在营养物质和药物转运机制的研究进展。

双特异性磷酸酶5对人胎盘滋养层细胞系BeWo增殖和凋亡的影响

目的探讨双特异性磷酸酶5(dual specificity phosphatase 5,DUSP5)基因过表达对人胎盘滋养层细胞系BeWo增殖和凋亡的影响及其可能机制。方法以携带人DUSP5基因的重组慢病毒感染BeWo细胞,用流式细胞仪分选建立过表达DUSP5的BeWo细胞模型,以携带空载体的慢病毒感染的细胞以及未经任何处理的细胞作对照。经荧光实时定量PCR和Western blot检测DUSP5基因mRNA和蛋白的表达,经CCK-8实验和流式细胞术检测BeWo细胞增殖和凋亡的变化,经Western blot检测磷酸化ERK(p-ERK)、p-p38及p-JNK的变化。结果①经荧光实时定量PCR和Western blot证实,成功构建了DUSP5过表达的人胎盘滋养层细胞BeWo细胞模型;②CCK-8实验结果显示DUSP5过表达组在第3、4、5天的光密度值D(490)与其他两对照组相比明显增高(P<0.01);流式细胞仪结果显示顺铂作用48 h后,DUSP5过表达组与空病毒载体组相比,正常细胞的百分比显著增加而早期凋亡细胞百分比则显著减少(P<0.01);Western blot结果显示DUSP5过表达组中p-ERK1/2水平显著下降,而p-p38和p-JNK未见明显变化。结论 DUSP5可促进人胎盘滋养细胞系BeWo增殖、抑制细胞凋亡,以上作用可能与DUSP5抑制ERK信号通路有关。

乙型肝炎病毒e抗原对Bewo细胞Toll样受体3表达的影响

目的探讨乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)对Bewo细胞Toll样受体3(TLR3)表达的影响。方法首先用TLR3配体polyI∶C处理Bewo细胞,观察细胞TLR3 mRNA表达的动力学变化。然后将2μg和8μg HBeAg重组质粒pcDNA3.1(+)-HBe转染Bewo细胞,48 h后,用TLR3配体polyI∶C处理12 h。最后,用不同浓度的IFN-β处理Bewo细胞12 h。采用实时荧光定量RT-PCR和ELISA分别检测细胞TLR3 mRNA表达及细胞上清IFN-β水平。结果 polyI∶C可显著诱导Bewo细胞TLR3 mRNA表达(P<0.05或0.001),且呈时间和剂量依赖性;与对照组相比,转染8μg HBeAg重组质粒组polyI∶C诱导Bewo细胞TLR3表达及IFN-β水平显著下降(P<0.001),IFN-β可显著诱导Bewo细胞表达TLR3 mRNA(P<0.001),且呈剂量依赖性。结论 HBeAg可能通过下调IFN-β的产生而抑制Bewo细胞TLR3 mRNA的表达,为防治HBV宫内感染提供了新的途径。

Toll样受体4介导抑制Bewo细胞中乙型肝炎病毒的复制

目的探讨Toll样受体4(TLR4)介导的天然免疫对Bewo细胞中乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。方法首先用TLR4配体LPS处理Bewo细胞,观察细胞TLR4 mRNA表达的动力学。然后将2μg 1.3倍HBV全基因重组质粒pcDNA3.1(+)-HBV1.3转染Bewo细胞,12h后,以LPS处理3d。最后,用抗TLR4处理Bewo细胞1h后,加入10μg/ml LPS刺激。采用荧光定量RT-PCR、微粒子酶免疫分析法(MEIA)和荧光定量PCR法分别检测细胞TLR4 mRNA表达、HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平。结果 LPS可显著诱导Bewo细胞TLR4 mRNA表达(P<0.05),呈时间和剂量依赖性;与对照组比较,LPS可显著抑制HBV复制(P<0.001),LPS对HBV DNA、HBsAg及HBeAg的抑制率(%)分别为29.70±6.03、32.12±5.98和33.89±1.28。抗TLR4可显著逆转LPS对HBV复制的抑制作用(P<0.01)。结论 TLR4介导的天然免疫可一定程度地抑制Bewo细胞中HBV复制,为防治HBV宫内感染提供了新的途径。

Toll样受体3介导抑制Bewo细胞中乙型肝炎病毒复制

目的探讨Toll样受体3(TLR3)介导的天然免疫对Bewo细胞中乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。方法首先用TLR3配体polyI:C处理Bewo细胞,观察细胞TLR3 mRNA表达的动力学。然后将2μg 1.3倍HBV全基因重组质粒pcDNA3.1(+)-HBV1.3转染Bewo细胞,12h后,以polyI:C处理3d。最后,用抗TLR3处理Bewo细胞1h后,加入25μg/ml polyI:C刺激。采用荧光定量RT-PCR、微粒子酶免疫分析法(MEIA)和荧光定量PCR法分别检测细胞TLR3mRNA表达、HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平。结果 polyI:C可显著诱导Bewo细胞TLR3 mRNA表达(P<0.05),呈时间和剂量依赖性;与对照组比较,polyI:C可显著抑制HBV复制(P<0.001),抗TLR3可显著逆转polyI:C对HBV复制的抑制作用(P<0.01)。结论 TLR3介导的天然免疫能一定程度抑制Bewo细胞中HBV复制,为防治HBV宫内感染提供了新的途径。

滨蒿内酯在BeWo细胞模型上的摄取转运特性分析

目的研究茵陈活性成分滨蒿内酯在BeWo细胞模型上的跨胎盘摄取转运特性。方法建立滨蒿内酯及内标物质双氯芬酸钠在细胞裂解液、Hank’s平衡盐溶液(HBSS)中的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析方法,并进行了方法学验证;MTT法考察滨蒿内酯(1、5、20、50、100、200、400、800、1000μmol/L)作用4 h对BeWo细胞活性的影响;应用建立的UPLC-MS/MS法考察给药时间、药物浓度、温度、pH值、转运蛋白抑制剂对BeWo细胞摄取滨蒿内酯的影响;以BeWo单层细胞为体外模型,应用Transwell孔板,考察给药时间、药物浓度、转运蛋白抑制剂对滨蒿内酯的跨胎盘转运的影响。结果建立的UPLC-MS/MS分析方法专属性强,灵敏度高,重现性好,提取回收率、基质效应和样品稳定性等均符合生物样品药物含量的分析测定要求。滨蒿内酯在浓度为1~800μmol/L时对BeWo细胞无明显毒性作用。滨蒿内酯在BeWo细胞上的摄取随时间和浓度变化呈线性增加,在所选取的浓度范围内无饱和趋势,不符合米氏方程;滨蒿内酯在BeWo细胞上的摄取量在4℃和37℃条件无显著性差异,表明摄取转运过程不受温度的影响;与生理条件下(pH 7.4)比较,在酸性条件下(pH 5.0或6.5),摄取量略有降低,无显著性差异;碱性条件下(pH 8.6),摄取量显著减少(P<0.001);滨蒿内酯在细胞膜刷状缘侧的摄取不受各类膜转运蛋白底物或抑制剂的影响。滨蒿内酯在BeWo细胞上的2个方向的转运速率无显著差异;二者表观渗透系数(Papp)值极为接近,药物外排率(Pratio)约为1;在考察的浓度范围(5、50、100、200、400μmol/L)内,滨蒿内酯在母-胎和胎-母2个方向上转运均呈线性增加,且无饱和趋势;滨蒿内酯在BeWo单层细胞的转运不受各类膜转运蛋白底物或抑制剂的影响。结论滨蒿内酯在BeWo细胞上的摄取及跨膜转运机制为非载体蛋白介导的被动转运。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇暴露对BeWo细胞炎症与凋亡相关基因表达的影响

目的观察脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)暴露对人胎盘绒毛癌细胞(BeWo细胞)炎症与凋亡相关基因表达的影响。方法将BeWo细胞进行培养和相应剂量(0～750 nmol/L)DON暴露,ELISA法检测人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)水平,qPCR法检测基因白细胞介素(IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α、环氧酶(Cox)-2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3和B淋巴细胞瘤(Bcl)-xl的表达水平。结果与空白对照组相比,50 nmol/L DON暴露组炎症和凋亡相关基因的表达呈显著性改变,即炎症相关基因IL-6、TNF-α和Cox-2在3、12和24 h时表达均显著上调(P<0.01),而IL-8仅在暴露24 h时显著上调(P<0.01),而凋亡相关基因Caspase-3在3、12和24 h时表达均显著低于对照组(P<0.01),而Bcl-xl的表达在暴露24 h时显著高于对照组(P<0.01)。结论 BeWo细胞DON暴露时炎症反应增强,凋亡被抑制,推测以上结果可能是DON胚胎发育毒性的潜在分子机制之一。

Toll样受体2在人绒毛外滋养细胞和绒癌细胞中的表达及意义

目的通过体外实验研究Toll样受体2(TLR2)在人早孕绒毛外滋养细胞株TEV-1及绒癌细胞株BeWo中的表达,初步探讨TLR2在绒癌发生发展中的作用和意义。方法体外培养TEV-1及BeWo细胞株,RT-PCR检测其TLR2 mRNA表达水平;免疫细胞化学检测TLR2蛋白的定位和半定量表达。结果 (1)TEV-1及BeWo细胞均表达TLR2,且定位于细胞膜和细胞浆。(2)TLR2的mRNA及蛋白表达水平在BeWo细胞明显高于TEV-1细胞(P<0.05)。结论 BeWo细胞明显高表达的TLR2可能与绒癌的发生、发展、转移和免疫耐受有关。