Bex2对胶质瘤细胞自噬及对替莫唑胺敏感性的影响

目的:探讨Bex2对胶质瘤细胞自噬、对替莫唑胺(TMZ)敏感性的影响及可能的作用机制。方法:①采用免疫组化法检测15例人脑胶质瘤组织和其癌旁正常组织中Bex2蛋白的表达。②将人脑胶质瘤U87 MG细胞分3组处理:空白对照组、siRNA-NC组、siRNA-Bex2组,后两组脂质体法转染相应质粒。qRT-PCR法检测细胞中Bex2 mRNA的表达,Western blot法检测Bex2和自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin1和P62的表达,CCK-8法检测细胞增殖,计算增殖抑制率。用不同浓度(0、25、50、100、200μmol/L)TMZ处理3组细胞48 h后检测细胞增殖抑制率,评估细胞对TMZ的敏感性。③将U87 MG细胞分4组处理:siRNA-NC组,siRNA-NC+TMZ组(转染siRNA-NC后使用100μmol/L TMZ处理48 h),siRNA-Bex2组和siRNA-Bex2+TMZ组。荧光显微镜下观察4组细胞自噬情况,Western blot法检测自噬相关蛋白和AMPK/mTOR信号通路相关蛋白的表达水平。结果:①人脑胶质瘤组织中Bex2阳性表达率为93.33%(14/15),高于癌旁正常组织(13.33%,2/15),P<0.001。②与空白对照组和siRNA-NC组比较,siRNA-Bex2组细胞中Bex2 mRNA和蛋白表达水平下降,Beclin1、LC3-Ⅱ表达水平下降,P62表达水平升高(P<0.05),细胞增殖抑制率升高,对TMZ的敏感性增强(P<0.05)。③siRNA-Bex2和TMZ均可降低U87 MG细胞的自噬水平,同时降低细胞中AMPK磷酸化水平降,升高mTOR磷酸化水平(P<0.05)。结论:下调Bex2表达可能通过抑制AMPK磷酸化和促进mTOR活化,抑制U87 MG细胞发生自噬,从而增强细胞对TMZ的敏感性。

Bex2抑制神经胶质瘤细胞凋亡及其与JNK/MAPK通路关系的研究

目的研究Bex2对神经胶质瘤细胞凋亡的影响并探讨其作用机制,为胶质瘤的基因治疗提供理论和实验依据。方法 1利用前期构建pEGFP-N1-Bex2真核表达载体,脂质体转染法过表达Bex2后12、24、48、72 h收集U251神经胶质瘤细胞,用流式细胞术检测细胞凋亡率,用免疫印迹法检测Bex2基因的表达及活化型caspase-3、p-JNK、p-c-Jun的变化。2收集临床神经胶质瘤手术标本,通过免疫组织化学检测Bex2、活化型caspase-3、p-JNK、p-c-Jun蛋白的表达,并与正常脑组织比较,分析它们之间的相关关系。结果 1流式细胞术检测结果显示,过表达Bex2后12、24、48、72 h各时间点细胞凋亡率明显低于空载体组(P<0.05),转染48 h组低于其他时间点组(P<0.05)。免疫印迹法检测表明,转染后48 h细胞的活化型caspase-3、p-JNK、p-c-Jun含量较空载体组和空白对照组降低(P<0.05)。2免疫组织化学结果表明,神经胶质瘤组织较正常脑组织中Bex2表达增高,活化型caspase-3、p-JNK、p-c-Jun蛋白低表达(P<0.05)。结论 Bex2在神经胶质瘤组织中高表达,并通过下调JNK/MAPK通路活性抑制胶质瘤细胞凋亡,进而促进肿瘤的发生和发展。

BEX2介导细胞自噬通路与小鼠结肠癌的分级、疗效及预后的相关性

目的BEX2介导细胞自噬通路与小鼠结肠癌的分级、疗效及预后的相关性。方法选取60只SD小鼠进行二甲肼颈背部皮下注射,注射频率1次/周,连续5周,建立结肠癌小鼠模型,并给予奥沙利铂15 mg/kg,腹腔注射,每周2次,连续给药8周。免疫组织化学法检测小鼠结肠癌组织BEX2、LC3-Ⅱ蛋白表达;Western blot法和Real-Time PCR检测结肠癌组织BEX2、LC3-Ⅱ蛋白含量和mRNA含量的表达;并分析BEX2、LC3-Ⅱ表达与小鼠结肠癌病理分期及复发转移的相关性。结果小鼠治疗后的结肠癌组织中的平均BEX2光密度、BEX2蛋白和mRNA表达量较治疗前均明显下降;而平均LC3-Ⅱ光密度、LC3-Ⅱ蛋白和mRNA表达量较治疗前均明显升高(P<0.05)。LC3-Ⅱ以及BEX2的阳性表达与结肠癌的浸润深度、淋巴结转移、分化程度、Dukes分期、是否远处转移以及TNM分期呈现显著相关性(P<0.05)。结论小鼠结肠癌组织中BEX2、LC3-Ⅱ异常表达与肿瘤转移密切相关,可作为预测结肠癌分级、疗效及预后的分子生物学靶点。

Bex2对人脑胶质瘤干细胞增殖、生长和凋亡影响的体外实验研究

目的观察Bex2真核表达载体对脑胶质瘤干细胞增殖、生长和凋亡的影响,为胶质瘤治疗提供理论基础。方法采用免疫磁珠系统分离、Nestin免疫组化鉴定人脑胶质瘤干细胞;将RT-PCR法获得的Bex2与质粒pcDNA3.1(+)连接,脂质体法转染胶质瘤干细胞,于转染18h、36h、48h、72h、96h后,采用Western Blot检测Bex2表达,MTT法及Hoechst染色试剂盒检测生长抑制率和凋亡情况。结果分离、培养出人脑胶质瘤干细胞,并成功构建Bex2的真核表达载体。转染后18hBex2即有表达,48h达到高峰,后渐下降;转染36h、48h、72h、96h时,细胞生长抑制率和凋亡率明显高于空载体组和空白对照组(P<0.05);转染72h时,细胞生长抑制率和凋亡率最高(P<0.05)。结论Bex2能够抑制脑胶质瘤干细胞的增殖和生长,诱导胶质瘤干细胞凋亡。

BEX2与INI1/hSNF5蛋白的相互作用及其在细胞周期中的功能鉴定

BEX2(Brain expressed X-linked protein 2)分子量约为13 kDa,高表达于人的脑和睾丸中。据报道,该蛋白在胚胎发育中表达量变化巨大,提示该蛋白可能在胚胎发育中具有重要作用,但迄今为止,其功能知之甚少。文章应用酵母双杂交系统,以BEX2为"诱饵"蛋白,筛选发现INI1/hSNF5是BEX2的一个结合蛋白。INI1/hSNF5是SWI/SNF染色质重塑复合体的核心组分,是"表观遗传"分子机制中的重要成员。文章通过体外GST Pull-down实验验证,BEX2与INI1/hSNF5之间的相互作是直接并且特异的。通过进一步的缺失突变分析,表明INI1/hSNF5的两个保守的反向重复序列是BEX2的结合区域。该区域是SNF5与多种蛋白相互作用的结构平台。亚细胞定位分析显示BEX2与INI1/hSNF5都主要集中分布于细胞核,这表明二者之间的相互作用可能参与基因表达调控的过程。文章进一步对此相互作用的功能进行了探讨,发现BEX2通过与INI1/hSNF5的相互作用从而影响细胞周期。

老年胃癌患者幽门螺旋杆菌感染与血清BEX2、APOC1、PIK3IP1表达的相关性

目的探讨老年胃癌患者幽门螺旋杆菌(Hp)感染与血清脑表达的X连锁基因2(BEX2)、载脂蛋白C1(APOC1)、磷脂酰肌醇3激酶相互作用蛋白1(PIK3IP1)表达的相关性。方法前瞻性选取2022年3月至2023年1月复旦大学附属中山医院青浦分院收治的老年胃癌患者86例,作为胃癌组,另选取同期在同院行胃镜检查的非胃癌者80例作为对照组。对比胃癌和非胃癌患者血清中BEX2、APOC1和PIK3IP1的mRNA水平及Hp感染U值,Hp不同感染程患者与未感染患者血清BEX2、APOC1、PIK3IP1的mRNA表达水平,不同临床病理特征患者血清BEX2、APOC1、PIK3IP1的mRNA表达水平,应用Pearson相关性分析BEX2、APOC1和PIK3IP1 mRNA水平与Hp感染U值的相关性,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清中BEX2、APOC1和PIK3IP1 mRNA表达水平对老年胃癌患者Hp感染诊断价值。结果胃癌患者血清中BEX2、APOC1 mRNA水平及Hp感染U值均明显高于对照组,胃癌患者血清中PIK3IP1 mRNA水平明显低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。HpⅠ级、HpⅡ级、HpⅢ级感染患者中BEX2、APOC1 mRNA水平均明显高于Hp未感染的患者,HpⅠ级、HpⅡ级、HpⅢ级感染患者中PIK3IP1 mRNA水平明显低于Hp未感染的患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。老年胃癌患者血清中BEX2、APOC1和PIK3IP1 mRNA水平与TNM分期、分化程度、淋巴结转移有关(P<0.05),与性别、年龄、肿瘤直径无关(P>0.05);老年胃癌患者血清中BEX2、APOC1 mRNA水平与Hp感染U值呈正相关(r=0.425、0.347,P<0.05),PIK3IP1 mRNA水平与Hp感染U值呈负相关(r=-0.323,P=0.002);3者联合检测诊断老年胃癌患者Hp感染的ROC曲线下面积AUC值明显优于BEX2、APOC1和PIK3IP1 mRNA 3者单独检测(P<0.05)。结论老年胃癌患者血清中BEX2和APOC1 mRNA表达升高,PIK3IP1 mRNA表达降低,与胃癌的TNM分期、分化程度、淋巴结转移及Hp的感染程度相关,3者联合检测BEX2、APOC1和PIK3IP1 mRNA对老年胃癌患者Hp感染具有一定的诊断效能。

真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2的构建及其在U251细胞中的表达

目的构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,并探索其在U251神经胶质瘤细胞中的表达。方法以正常人脑组织总RNA为模板,采用RT-PCR法获得Bex2的cDNA,并与pEGFP-N1载体连接,构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒。对pEGFP-N1-Bex2重组质粒的菌液行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定。在U251细胞中用脂质体转染法转染pEGFP-N1-Bex2真核表达载体过表达Bex2,分别于转染后12、24、48、72h收集细胞,用Western blot检测Bex2基因的表达情况。结果真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2经PCR及双酶切鉴定,均可见387bp的目的基因条带,并单倍正向克隆至质粒中。转染质粒pEGFP-N1-Bex2后荧光显微镜下观察U251细胞内有绿色荧光蛋白表达,Western blot检测见47KD和26KD分别有清晰的外源性Bex2-GFP融合蛋白和GFP蛋白的表达。pEGFP-N1-Bex2在转染U251细胞后12h即有表达,48h达到高峰。结论成功构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,瞬时转染后在U251细胞中顺利表达。

脑表达X连锁基因2在结直肠癌的表达及其临床应用价值

目的探究脑表达X连锁基因2(brain-expressed X-linked gene 2,BEX2)在结直肠癌(colorectal cancer,CRC)患中的表达及其对病理和预后的影响。方法收集2013年至2017年在本院接受结直肠癌根治术的165例患者临床病理信息,采用免疫组化法及蛋白印迹法评估结直肠癌组织与癌旁组织中BEX2表达的差异;分析BEX2表达与结直肠癌患者临床病理特征和预后的关系;使用TCGA数据库探究BEX2表达与结直肠癌患者接受临床免疫治疗的效果。结果免疫组织化学染色发现BEX2在结直肠癌组织中高表达(P<0.01);结直肠癌组织中BEX2表达量与Ki-67表达量呈现显著的正相关关系(r=0.654,P<0.01)。结直肠癌中BEX2的表达量与血清癌胚抗原(Carcinoembryonic Antigen,CEA)(r=0.462,P<0.01)及碳水化合物抗原19-9(Carbohydrate Antigen 19-9,CA19-9)(r=0.590,P<0.01)存在正相关性。以BEX2的表达量中位数(2.98)为界,分为BEX2高表达组(n=83)和BEX2低表达组(n=82);BEX2高表达组的CEA≥5μg/L、CA19-9≥37 kU/L、T3~4期以及N2~3期的比例显著高于BEX2低表达组(P<0.05);Cox回归模型显示:BEX2高表达、CEA≥5μg/L、CA19-9≥37 kU/L、T3~T4及N2~N3为影响胃癌根治术后5年生存期的独立危险因素;BEX2表达量预测患者术后5年生存的敏感性为72.09%和特异性为73.42%,曲线下面积为0.740,最佳截点值2.99;K-M生存分析显示BEX2高表达组患者结直肠癌根治术后5年生存率显著低于BEX2低表达组(Log-rankχ^(2)=41.882,P<0.01);综合分析TCGA数据库以及GSE92921、GSE38832、GSE161158中结直肠癌患者的转录组数据和临床病理数据,CRC肿瘤分期越晚,BEX2表达量越高;BEX2高表达的结直肠癌患者在多种免疫调节状态下的抗肿瘤免疫反应更差且免疫相关的功能受到抑制,低表达BEX2的结直肠癌患者接受PD-1单抗(P=0.027)或联合PD-1和CTLA4单抗(P=0.0018)的治疗效果更好。结论BEX2在结直肠癌中高表达并与结直肠癌的发生发展呈紧密相关,是结直肠癌术后5年独立影响因素,对预后评估、免疫治疗具有一定临床价值。