简易BH3分析法在血液肿瘤药敏筛选的初步探索

目的建立一种血液肿瘤BCL-2抗凋亡蛋白抑制剂药敏筛选的简易BH3分析法。方法建立基于显微镜和JC-1染色的BH3分析方法,通过BH3-only模拟肽描绘K562、NB4细胞系BCL-2家族抗凋亡蛋白依赖谱,应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)加以验证;回溯临床治疗疗效,检验该方法对临床样本BH3药敏分析结果的符合情况。结果BH3分析结果显示NB4对抗凋亡蛋白的依赖程度依次为BCL2>MC1-1>BCL-XL;K562的依赖程度依次为BCL-XL>MC1-1>BCL2。PCR分析BCL-2家族基因表达量显示,K562抗凋亡蛋白MCL-1、BCL2、BCL-XL相对表达程度较高,BH3-only促凋亡蛋白中BIM、PUMA、NOXA高表达而HRK低表达,细胞抗凋亡能力更依赖于BCL-XL;NB4抗凋亡蛋白BCL-XL表达明显低于MCL-1与BCL-2,BH3-only促凋亡蛋白NOXA低表达,细胞抗凋亡更依赖于MCL-1与BCL-2而非BCL-XL,与BH3分析结果相符。对连续6例血液肿瘤患者骨髓进行BH3分析,结果显示6例患者均对HRK(BCL-XL抑制物)、VEN(BCL-2抑制物)不敏感;4例患者(例1~3,例5)对NOXA(MCL-1抑制物)表现为敏感,2例(例4、例6)的敏感度较低(<50%)。药敏预测结果显示6例患者均对BCL-2抑制剂耐药,例1~3、例5患者对MCL1抑制剂敏感,例4和例6对MCL1抑制剂可能耐药。回溯临床用药效果(4~6个疗程)显示例1~5患者对BCL-2抑制剂相关方案治疗无效,考虑与BCL-2抑制剂不敏感有关,例5更换西达苯胺治疗有效,例4和例6患者西达苯胺相关方案疗效不佳,考虑与MCL-1抑制物不敏感有关,上述临床结局与BH3预测结果一致。结论基于荧光显微镜和JC-1染色的BH3分析是简便可行的,可用于检测血液肿瘤细胞对不同抗凋亡蛋白的依赖性,从而为BCL-2家族相关抑制剂的选择提供证据。

仅含BH3区域蛋白(BOPs)与Bax的研究

仅含BH3区域蛋白(BH3-onlyproteins,BOPs)及Bax均属于Bcl-2蛋白家族,其功能为调整细胞凋亡,不同的仅含BH3区域蛋白受不同的机制调节。二者功能的改变与多种疾病的发生有关,现就仅含BH3区域蛋白的作用机制、功能调节及二者在疾病防治中的作用简要综述。

仅含BH3区域蛋白与妇女疾病关系研究进展

BH3-onlyproteins(仅含BH3区域蛋白)属于Bcl- 2蛋白家族,功能为促进细胞凋亡,不同的仅含BH3区域蛋白受不同的机制调节。其功能的改变与多种疾病的发生有关,该文就仅含BH3区域蛋白的作用机制、功能调节及在妇女疾病中的作用进行综述。

BH3类似物促细胞凋亡机制及临床研究进展

靶向细胞凋亡是目前癌症治疗中最具发展前景的治疗方法之一。BCL-2家族的BH3-only蛋白(仅含BCL-2同源结构域BH3)可以通过与家族中促存活蛋白结合,使促存活蛋白失效,从而使促凋亡成员发挥作用,最终导致细胞发生程序性凋亡。BH3类似物即一类可以模仿BH3-only蛋白并诱发细胞凋亡的小分子化合物。BH3类似物的原型ABT-737可以选择性靶向BCL-XL、BCL-2和BCL-W 3个促存活蛋白(但不能作用于髓细胞白血病因子-1蛋白或A1蛋白),而它的衍生物ABT-263(navitoclax)在临床试验中有显著的促凋亡与抗肿瘤效应。现阶段,一些推测为BH3类似物的药物已经进入了临床阶段,但很大一部分仍在进行特征鉴定。本文在概述BH3-only蛋白作用机制的基础上,综述了多种已经广泛认可的BH3类似物及正在研究当中的最新BH3类似物。

细胞凋亡中的Bcl-2家族蛋白及其BH3结构域的功能研究

凋亡相关蛋白中的Bcl-2家族是细胞凋亡的关键调节分子,由抗凋亡和促凋亡成员组成,这些成员之间通过相互协同作用调节了线粒体结构与功能的稳定性,从而在线粒体水平发挥着细胞凋亡的“开关”作用.抗凋亡成员大都分布于线粒体的外膜,与促凋亡成员的BH3结构域相互作用对细胞凋亡发挥抵抗作用.促凋亡成员则主要分布于细胞浆中,细胞接受死亡信号刺激后,促凋亡成员自身受到一系列的调节,如典型的Bax构象改变、BAD和Bik的磷酸化调节以及Bid和Bim的蛋白裂解效应等,使得促凋亡成员在凋亡信号的刺激下整合于线粒体外膜,最终导致线粒体通透转换孔的开放,进而释放包括细胞色素c、凋亡诱导因子、Smac等重要的凋亡因子,随后caspase被激活进而断裂重要的细胞内结构蛋白与功能分子,执行细胞凋亡.

子宫内膜癌组织中p-PKB及仅含BH3域蛋白的表达及其相关性

目的:研究子宫内膜癌组织中磷酸化PKB、磷酸化Bad及Bim蛋白及mRNA表达水平,并探讨其与子宫内膜癌发生的关系以及三者间表达的相关性。方法:采用免疫组化方法检测11例正常增殖期子宫内膜、13例非典型增生子宫内膜及55例子宫内膜癌组织中p-PKB、p-Bad及Bim蛋白表达情况,以及采用逆转录聚合酶链反应检测上述子宫内膜组织中PKB、Bad及BimmRNA表达水平。结果:与正常子宫内膜组织比较,子宫内膜癌及非典型增生组织中p-PKB及p-Bad蛋白表达阳性率明显增加(P=0.001;P<0.001);而Bim蛋白的表达则显著减少(P<0.001),差异有显著性;PKBmRNA及BadmRNA在正常子宫内膜、非典型增生内膜及子宫内膜癌之间表达的阳性率无明显差异(P>0.05),只有BimmRNA在正常子宫内膜组织中表达的阳性率明显高于非典型增生内膜及子宫内膜癌组织(P=0.006)。结论:PKB途径的激活与子宫内膜癌的发生密切相关。其激活后可通过多种机制作用于仅含BH3域蛋白,抑制其促凋亡活性,导致子宫内膜细胞过度增殖以及子宫内膜癌的发生。

急性髓系白血病原代细胞BCL-2家族蛋白表达与BH3模拟物S1关系的研究

目的:探讨唯BH3域(BH3 only domain,BH3)模拟物3-硫吗啉基-8-氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯-9-腈(S1)诱导急性髓系白血病(AML)原代细胞凋亡的分子标志物。方法:分离27例人初发AML的单个核细胞,使用流式细胞术检测细胞凋亡。通过四氮唑盐(XTT)法检测S1作用下AML细胞的半数抑制浓度(IC50)。应用Western blot测定AM L细胞中BCL-2家族蛋白及磷酸化BCL-2(p BCL-2)蛋白表达量,并通过光密度法进行半定量分析。通过XTT法及免疫共沉淀法检测S1与特异性信号调节激酶MEK/ERK抑制剂PD98059联合作用下的AML细胞活性及其BCL-2家族蛋白之间的相互作用。结果:S1能够诱导AM L原代细胞凋亡。根据AM L原代细胞对S1的敏感度不同,将27例AML原代细胞分为3组:1敏感组12例,IC50<15μmol/L;2中度敏感组8例,14μmol<IC50<30μmol/L;3耐药组7例,IC50>30μmol/L。p BCL-2/(BCL-2+M CL-1)的比值与IC50呈现良好的线性相关性(R2=0.71,P<0.0001)。在PD98059的协同作用下,p BCL-2水平下调,S1诱导AM L原代耐药组细胞的凋亡率由9.8%显著提升至64.5%(联合指数CI=0.4),并且促进了AM L原代耐药细胞BCL-2家族蛋白之间形成异源二聚体的解离。结论:S1与PD98059的联合作用能够降低AML患者p BCL-2水平,干扰BCL-2与促凋亡蛋白的相互作用。

BH3结构域拟似物BH3I-2'诱导人白血病细胞凋亡机理的探讨

目的:探讨BH3结构域拟似物BH3I-2'诱导白血病细胞发生凋亡的潜在机制,为其临床应用提供理论依据。方法:应用流式细胞仪、ELISA分析、WesternBlotting印渍技术检测BH3I-2'作用后白血病细胞K562、CEM的凋亡情况、线粒体△Ψm、ROS变化、NF-κB活性及凋亡相关蛋白表达。结果:BH3I-2'能显著诱导白血病细胞凋亡,引起细胞线粒体跨膜电位△Ψm下降、ROS生成并同时激活核转录因子NF-κB及抗凋亡蛋白的上调。结论:BH3结构域拟似物BH3I-2'通过消耗线粒体跨膜电位,诱导细胞氧自由基ROS生成,进而造成线粒体内膜损伤,触发线粒体通路引起细胞凋亡;并且也同时诱导了NF-κB、抗凋亡蛋白激活表达,提示药物诱导肿瘤细胞凋亡的同时也启动了细胞自身的保护机制。

PUMA-BH3结构域短肽的原核表达、纯化及促凋亡活性鉴定

Bcl-2家族蛋白质在线粒体途径凋亡的调控机制中起着重要的作用,p53正向细胞凋亡调控因子(p53 up-regulated modulator of apoptosis protein,PUMA)是该家族的一种只含有BH3同源区域的促凋亡蛋白。为得到PUMA的BH3结构域短肽并检测其生物学活性,将人工合成的编码PUMA-BH3肽的DNA片段克隆到质粒pTYB2上,构建出表达PUMA-BH3-内含肽-几丁质结合域融合蛋白的原核表达载体pTYB2-PUMA-BH3,转化大肠杆菌BL-21(DE3)中IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经几丁质亲和层析、二硫苏糖醇(DTT)的柱内还原,直接获得可溶性PUMA-BH3肽。通过研究重组PUMA-BH3肽在体外条件下对线粒体活力、线粒体肿胀度以及细胞色素c释放的影响来鉴定其生物学活性。结果表明,获得的可溶性PUMA-BH3肽能作用于离体线粒体,引起线粒体活力降低,线粒体肿胀并能诱导细胞色素c释放。环孢菌素A对此有一定的抑制作用,提示PUMA-BH3肽对线粒体的上述作用是通过促进通透性转运孔(PTP)开放实现的。经原核表达及纯化,获得了具有促凋亡活性的PUMA-BH3肽,为进一步研制控制凋亡过程的药物奠定了基础。

BH3诱导肺癌H1299细胞凋亡的试验研究

目的研究肽BH3抗人非小细胞肺癌细胞株H1299的作用,并探讨其作用机制。方法体外培养H1299细胞,取10μM、100μM和1000μM浓度的BH3作用于H1299细胞,72h后,用RT-PCR检测Bcl-2、Capase3和Bcl-xL的表达变化、测定Capase3和Capase9的活性并观察体内外细胞生长的抑制情况。结果 RT-PCR结果显示,不同浓度的BH3作用后,Bcl-2、Capase3和Bcl-xL的表达表现出相应变化,Capase3和9的活性也有增高的趋势。BH3对细胞有明显的抑制作用,24h后,抑制率分别为2.34%、17.5%、24.46%;48h后,抑制率分别为8.72%、20.33%、45.17%;72h后,抑制率分别为13.11%、38.90%、50.24%。BH3(10μM、100μM和1000μM)对裸鼠移植性非小细胞肺癌细胞株H1299也有抑制作用,3个剂量组的抑瘤率分别为43.85%,54.92%和59.02%。结论肽BH3有促进H1299细胞凋亡的作用。降低高表达的Bcl-2和Bcl-xL基因,升高Ca-pase3基因,可能是BH3抗人非小细胞肺癌的机制之一。

BH3-only蛋白与凋亡

BH3-only蛋白（bcl-2 homology domain only proteins）是Bcl-2蛋白家族中启动和调节细胞凋亡的重要成员，能识别不同的细胞刺激形式并被活化，其活性受转录和／或翻译后修饰的调节。BH3-only蛋白通过抑制Bcl-2抗凋亡成员的活性或激活Bax／Bak样促凋亡成员的活性来调节细胞凋亡，在组织发育、维持内环境稳定、防止自身免疫病和肿瘤的发生中有着极其重要的作用。本文主要就BH3-only蛋白对凋亡的调控研究作一综述。

BH3-HIV-TAT抗前列腺癌的活性

目的:探讨人工合成的BH3-HIV-TAT肽对前列腺癌细胞株LNCaP增殖的影响。方法:以25、50、1000μmol/L的BH3-HIV-TAT处理LNCaP细胞12或24h,以激光共聚焦显微镜观察BH3-HIV-TAT肽的细胞定位;观察经BH3-HIV-TAT肽处理后,LNCap细胞凋亡过程中核染色质的形态学变化;用流式细胞仪分析不同时间不同浓度的短肽对细胞凋亡程度和周期的影响;以MTS/PMS测定,分析短肽对LNCaP细胞的增殖是否有浓度依赖性的影响。结果:激光共聚焦检测结果显示BH3-HIV-TAT肽主要定位在细胞核内;LNCap细胞经短肽处理后,可观察到分为2期的细胞凋亡过程;流式细胞仪检测结果证实了短肽对细胞凋亡程度和周期的影响;MTS/PMS测定表明该短肽具有浓度依赖性的抗前列腺癌细胞的活性。结论:BH3-HIV-TAT肽可有效地诱导前列腺癌细胞株LNCaP的凋亡,从而影响其增殖,实验结果为癌症靶向性治疗提供了依据。

BH3-only蛋白在非小细胞肺癌靶向治疗中的作用及意义

肺癌死亡率居全球恶性肿瘤死亡之首,非小细胞肺癌是肺癌中最常见的类型。在传统的抗肺癌治疗中,促进细胞凋亡是非小细胞肺癌治疗的一个重要组成部分,但抗肿瘤药物存在毒副作用大和耐药性等问题。因此,寻找新的抗肿瘤药物作用靶点成为非小细胞肺癌治疗的重点之一。BH3-only蛋白在凋亡的启动及凋亡通路的沟通中发挥极其重要的作用。BIM是BH3-only蛋白家族中的核心成员。以BIM为靶点的治疗在非小细胞肺癌的治疗中具有不可取代的作用。本文简单介绍了BCL-2家族和其中的BH3-only促凋亡蛋白,并且阐述了BIM、BH3-only蛋白在非小细胞肺癌靶向治疗中的重要作用。

树脂基复合材料模压成型用BH315-3D温度场采集系统

针对复合材料模压成型过程的工艺特性 ,本文研制了一套温度场采集系统。该系统具有采集速度快、灵敏度高、自动化程度高的特点 ,能够直观、实时地显示复合材料模压成型过程中片层内部温度 时间 位置三维分布图 。

Co基合金催化NH3BH3/LiBH4水解制氢性能的研究

使用Na BH_4还原金属盐制备非晶态纳米合金Co-Ni-W-B催化剂,改进NH_3BH_3/Li BH_4复合体系的室温水解放氢性能。使用物理吸附仪、XRD、SEM等对合金催化剂进行了表征。实验表明,通过Co-Ni-W-B的催化,NH_3BH_3/Li BH_4复合体系于室温条件下在10 min内完成放氢。当进一步加入Ni Cl_2,可使该体系在6 min内完成放氢。实验研究了复合催化剂的循环催化性能,并利用质谱仪对复合体系的催化放氢产物进行了检测,发现产物中只有氢气存在,可直接为燃料电池供氢。

BH3模拟物类抗肿瘤药物研发进展

BH3模拟物类抗肿瘤药物是一类靶向于Bcl-2家族抗凋亡成员蛋白的新型抗肿瘤药物。该类药物可以模仿唯BH3域蛋白的BH3结构域与Bcl-2家族抗凋亡成员结合并使其释放促凋亡成员。释放后的促凋亡成员可以诱导肿瘤细胞发生Bax/Bak依赖性凋亡,从而实现BH3模拟物的抗肿瘤作用。BH3模拟物类抗肿瘤药物以其优越的抗肿瘤活性成为抗肿瘤药物开发领域的一个热点。本文针对BH3模拟物类抗肿瘤药物的开发进展做一综述。

唯BH3域蛋白在肿瘤治疗中的研究进展

唯BH3域蛋白作为Bcl-2蛋白家族的一大亚类,通过抑制Bcl-2抗凋亡蛋白和(或)激活Bcl-2促凋亡蛋白,在调节细胞凋亡的过程中起着极其重要的作用。许多癌症中编码唯BH3域蛋白的基因发生严重突变,而且在小鼠中敲除这些基因后可诱导肿瘤的发生,这提示唯BH3域蛋白可作为肿瘤抑制剂。唯BH3域模拟物正发展为新型小分子靶向抗癌药物,这可能有助于为肿瘤设计更好的治疗策略。

BH3分析技术研究进展及其应用

许多化疗药物发挥作用的重要方式是通过诱导线粒体介导的细胞凋亡.细胞凋亡在维持正常机体的内环境稳态中有重要作用,而在肿瘤细胞中,细胞凋亡的失调成为肿瘤细胞逃避化疗药物杀灭细胞作用的一道屏障. BCL-2家族蛋白在调节线粒体诱导的凋亡中处于中心地位,因此一项基于BCL-2家族蛋白的检测技术,BH3分析技术应运而生.该项技术的提出或许能为肿瘤的个性化治疗提供新的思路.本文重点综述BH3分析技术的原理,以及在肿瘤化疗药物选择和新型化疗药物开发中的应用.

BH3拟似药物的发现及与组蛋白去乙酰化酶抑制剂的协同抗肿瘤作用

目的BH3-only蛋白是Bcl-2家族的促凋亡成员,可与抗凋亡成员结合启动肿瘤细胞凋亡和自噬。BH3拟似药通过模拟BH3-only蛋白促进肿瘤细胞凋亡和自噬,是肿瘤治疗中最具前景的药物之一。因此我们的研究目的是寻找新的BH3拟似药并阐明其抗肿瘤作用机制,为发展新的BH3拟似药奠定基础。方法通过基于药效团模型的虚拟筛选技术和分子对接筛选出潜在的BH3拟似化合物。用MTS实验检测筛选出来的化合物对多种肿瘤细胞的抑制率。采用AnnexinV/PI双染流式细胞术检测化合物对细胞凋亡的影响,免疫共沉淀(Co-IP)检测化合物对Bcl-2/Beclin-1复合物的影响。共聚焦显微镜检测化合物对肿瘤细胞自噬的影响,采用Western印迹法检测凋亡和自噬相关蛋白的表达。通过hoechst 33342染色、透射电镜、MDC染色检测AD23联合伏立诺他对肿瘤细胞蛋白与自噬的影响,动物实验检测AD23联合伏立诺他的抗肿瘤效果。结果筛选出BH3拟似化合物AD23。分子对接和表面等离子共振实验结果表明,AD23可与Bcl-2,MCL^(-1)和Bcl-XL蛋白结合,通过MTS实验发现AD23抑制小细胞肺癌细胞系作用最强。AnnexinV/PI双染实验结果显示,AD23可以浓度依赖性的促进H82细胞凋亡。Western印迹实验结果显示,AD23可以剂量依赖性诱导胱天蛋白酶3活化,诱导C-PARP蛋白增多从而激活凋亡通路。mCherry-GFP-LC3质粒转染结果显示,AD23可以浓度依赖性的促进自噬流过程的发生。Co-IP实验结果表明,AD23可时间依赖性促进Bcl-2与Beclin-1解离,AD23可以浓度依赖性的上调LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比例增加,下调P62蛋白的表达,从而激活自噬通路。细胞及动物实验结果表明AD23联合伏立诺他给药组促进H82细胞凋亡与自噬较单独给药组明显增加。结论BH3天然拟似化合物AD23可促进小细胞肺癌细胞凋亡与自噬,AD23与伏立诺他具有协同抗肿瘤作用。