中风活心软胶囊通过靶向微小RNA-126诱导缺氧诱导因子-1α/促凋亡调节蛋白BNIP3信号通路促进自噬减轻脑缺血再灌注损伤大鼠神经损伤的作用机制研究

目的探讨中风活心软胶囊通过靶向微小RNA(miRNA)-126诱导缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/促凋亡调节蛋白BNIP3信号通路促进自噬减轻脑缺血再灌注损伤大鼠神经损伤的作用机制。方法选取30只无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠,随机分为空白组、模型组与治疗组,每组10只。采用Zea Longa法建立右侧大脑中动脉缺血(MCAO)大鼠模型。治疗组给予中风活心软胶囊。采用改良神经功能损害评分(mNSS)评估大鼠神经功能缺损情况,透射电镜观察缺血半暗区皮质神经元及自噬囊泡超微结构,蛋白质免疫印迹(WB)法和实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法分别检测缺血半暗区皮质雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、HIF-1α蛋白及其mRNA和miR-126的表达水平。结果模型组、治疗组mNSS评分均高于对照组,但治疗组低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、治疗组缺血半暗区皮质mTOR、HIF-1α蛋白表达水平均高于对照组,但治疗组低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、治疗组缺血半暗区皮质mTOR、HIF-1αmRNA表达水平均高于对照组,miR-126表达水平低于对照组,但治疗组mTOR、HIF-1αmRNA表达水平低于模型组,miR-126表达水平高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组缺血半暗区皮质神经元及电镜下自噬囊泡数量明显增加,细胞结构损坏减轻。结论中风活心软胶囊可显著提高脑缺血大鼠缺血半暗区皮质mTOR、HIF-1α因子表达,其作用机制可能是通过激活miR-126表达进而靶向调控mTOR/HIF-1α信号通路,促进自噬,从而发挥其脑保护效应。

BH3-only促凋亡蛋白的研究进展

凋亡是细胞的程序性死亡,它对多细胞生物个体的发育、维持自身发展平衡以及抵御刺激起着非常关键的作用.大多数情况下,细胞生死主要由Bcl-2家族蛋白的相互作用实现[1].……

BH3-only蛋白与凋亡

BH3-only蛋白（bcl-2 homology domain only proteins）是Bcl-2蛋白家族中启动和调节细胞凋亡的重要成员，能识别不同的细胞刺激形式并被活化，其活性受转录和／或翻译后修饰的调节。BH3-only蛋白通过抑制Bcl-2抗凋亡成员的活性或激活Bax／Bak样促凋亡成员的活性来调节细胞凋亡，在组织发育、维持内环境稳定、防止自身免疫病和肿瘤的发生中有着极其重要的作用。本文主要就BH3-only蛋白对凋亡的调控研究作一综述。

BH3-only促调亡蛋白研究进展

细胞凋亡在多细胞生物的发育、组织稳态的维持等方面发挥重要的作用。近年来发现的BH3 only促凋亡蛋白是BCL 2家族促凋亡成员中的一大亚类 ,在不同凋亡刺激作用下 ,通过拮抗BCL 2和BCX Xl等抗凋亡蛋白及协助BAX和BAK等促凋亡蛋白参与凋亡反应 ,是细胞凋亡过程中重要的起始因子。

miRNA-1297通过靶向BH3结构域凋亡诱导蛋白促进肝细胞癌的进展

目的该研究旨在探讨miR-1297在肝细胞癌中的表达水平,及其对肝细胞癌癌细胞增殖和凋亡的影响。方法分析109对肝癌组织和配对的癌旁组织中miR-1297的表达情况。从上述队列患者的生存资料中分析miR-1297的表达与肝癌患者预后的关系。应用qRT-PCR技术检测肝细胞癌中miR-1297上调表达的机制。应用CCK8试验测定miR-1297在肝细胞癌发生发展中的作用。用Annexin V/丙碘化物染色检测HCC细胞凋亡。用蛋白质免疫印迹分析法研究与BH3结构域凋亡诱导蛋白(BID)的表达。结果相对癌旁正常组织和人正常肝细胞,miR-1297在肝癌组织和肝癌细胞中表达上升。Kaplan-Meier分析提示癌组织中高表达miR-1297的肝癌患者预后较差。在SMMC-7721和HepG2转染miR-1297表达抑制剂可抑制肝癌细胞增殖,促进其凋亡。生物信息学分析提示BID为miR-1297直接调控靶基因;荧光素酶报告基因检测提示miR-1297可与BIDmRNA 3'UTR结合;蛋白质印迹分析证实miR-1297可抑制肝癌细胞BID蛋白的表达。进一步研究提示,抑制miR-1297表达显著提高线粒体中tBID和细胞色素C的表达水平。拯救实验证实在肝癌细胞中miR-1297通过靶向BID蛋白抑制肝癌细胞凋亡。结论证实miR-1297通过靶向BID促进肝癌的进展,提示其可能是肝细胞癌患者潜在的预测预后的临床标志物和治疗靶点。

氨甲酰化促红细胞生成素对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及cleaved Caspase-3蛋白表达的影响

目的观察氨甲酰化促红细胞生成素(CEPO)对慢性心力衰竭(CHF)大鼠心功能、心肌细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白活化表达的影响。方法将30只雄性成年SD大鼠随机分为假手术(Sham)组(n=10)、CEPO组(n=10)和对照(Control)组(n=10),采用腹主动脉缩窄术制作慢性心力衰竭模型,术后第8周CEPO组开始经腹腔注射50μg/kg CEPO,3次/周,连续4周;Sham组、Control组同期经腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。术后第8周、12周行心脏彩超检测大鼠心功能。术后第12周末取大鼠心肌组织切片采用HE染色法观察心肌组织细胞形态;采用原味缺口末端标记(TUNEL)法检测心肌细胞凋亡及计算凋亡指数(AI);采用Western blot印迹法检测心肌活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)蛋白表达水平。结果与假手术组相比,建模大鼠术后第8周时出现心室肥厚及左室射血分数(LVEF)减退;CEPO组干预4周后左室射血分数较Control组明显升高(P<0.05),收缩末期室间隔厚度(IVSs)、收缩末期左心室后壁厚度(LVPWs)、舒张末期室间隔厚度(IVSd)、舒张末期左心室后壁厚度(LVPWd)明显降低(P<0.05)。与Control组比较,CEPO组AI值显著降低[(23.87±1.45)%vs(30.15±0.67)%,P<0.05],cleaved Caspase-3表达水平(0.489 1±0.029 1)明显减少(P<0.01)。结论 CEPO可通过抑制凋亡关键酶Caspase-3的活化,显著减少cleaved Caspase-3蛋白的表达水平,减少心肌细胞凋亡以改善心功能。

促红细胞生成素对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及对cleaved Caspase-3蛋白表达的影响

目的观察促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌细胞的抗凋亡作用及对活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)蛋白表达的影响。方法将36只雄性成年SD大鼠随机分为3组,分别为假手术(Sham)组(n=12)、EPO组(n=12)和对照(Control)组(n=12);其中EPO组和Control组大鼠使用腹主动脉缩窄术建立慢性心力衰竭模型,术后第8周EPO组经腹腔注射3 000 U/kg EPO,3次/周,连续4周;Sham组、Control组经腹腔注射等量等次0.9%氯化钠溶液。术后第4周、8周、12周行超声心动图检测大鼠心功能。术后第12周末全部大鼠禁食24 h后处死,取心肌组织切片采用苏木精-伊红(HE)染色法观察心肌组织细胞形态,采用Tunel法观察心肌细胞凋亡及计算凋亡指数(apoptosis index,AI);采用Western blot法检测心肌cleaved Caspase-3蛋白表达情况。结果超声心动图结果显示,造模大鼠术后第4周时出现心室肥厚,术后第8周时出现左心室射血功能减退;EPO组干预4周后较Control组左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)明显升高(P<0.05),收缩末期室间隔厚度(IVSs)、收缩末期左心室后壁厚度(LVPWs)、舒张末期室间隔厚度(IVSd)、舒张末期左心室后壁厚度(LVPWd)明显降低(P<0.05)。EPO组AI相比Control组显著降低(23.87%±1.45%vs.35.58%±2.81%,P<0.01);与Sham组比较,Control组cleaved Caspase-3 OD值明显增加(0.3 145±0.0 308 vs.0.9 007±0.0 339,P<0.01);与EPO组相比,Control组减少(0.4 893±0.0 683 vs.0.9 007±0.0 339,P<0.01),差异均有统计学意义。结论 EPO可明显改善慢性心力衰竭大鼠的心功能,减少心肌细胞凋亡,对心肌具有保护作用,其机制可能与下调凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3蛋白表达相关。

重组人促红细胞生成素对大鼠癫痫持续状态X-连锁凋亡抑制蛋白的影响及作用机制的实验研究

目的观察重组人红细胞生成素(r Hu EPO)对戊四氮(PTZ)点燃的癫痫持续状态(SE)的SD大鼠海马神经元的影响,应用磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002,观察X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的变化情况,进一步探讨r Hu EPO作用的可能机制。方法采用PTZ点燃大鼠SE模型,将大鼠随机分为正常对照组(生理盐水,NS)、PTZ组(PTZ+NS)、r Hu EPO组(PTZ+r Hu EPO)、LY294002组(PTZ+LY294002+r Hu EPO)、二甲基亚砜(DMSO)对照组(PTZ+DMSO+r Hu EPO),检测大鼠行为学和脑电图(EEG)的改变及苏木精-伊红染色观察海马病理学的改变;免疫组织化学法观察磷酸化蛋白激酶B(p-PKB/p-Akt)、X-连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的表达;反转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测各组大鼠海马XIAPm RNA的表达,Western blot方法检测各组大鼠海马Akt、p-Akt、XIAP蛋白的表达。结果 PTZ点燃大鼠SE后下调了p-Akt、XIAP的表达;r Hu EPO可以增加p-Akt、XIAP的表达,发挥神经保护作用;加入PI3K抑制剂LY294002,海马p-Akt、XIAP蛋白、XIAPm RNA的表达较r Hu EPO组减少,减弱了r Hu EPO的保护作用。结论从正反两个方面佐证了PI3K/Akt信号通路是r Hu EPO发挥神经保护作用的通路之一,其作用机制可能是r Hu EPO活化PI3K/Akt通路后,对线粒体凋亡途径的相关调控因子XIAP的表达进行了调控,进而介导线粒体凋亡途经,发挥抗凋亡、促存活的神经保护作用。

促红细胞生成素对β-淀粉样蛋白引起细胞损伤后坏死样凋亡的保护作用

目的探讨促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）对β-淀粉样蛋白（Aβ325—35）诱导的HT-22细胞损伤后坏死样凋亡（necroptosis）的保护作用及可能机制。方法四甲基偶氮唑蓝法（MTT）观察不同浓度的A[325—35（1-20μmol／L）作用于HT-22细胞24h，及不同浓度EPO（1—50U）预处理3h后再加入20μmol／LAβ25—3524h对HT-22细胞活力的影响；Hoechst33258核染色法观察细胞形态，蛋白免疫印迹法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的表达。结果不同浓度的Aβ25—35作用HT-22细胞24h后均引起细胞活力的下降，且活力下降呈剂量依赖性；不同浓度的EPO对20μmol／LAβ25—35引起的细胞活力下降具有抑制作用。10μEPO可有效地抑制20μmol／LAβ25—35诱导的caspase-3的裂解片段表达增加。核染色表明EPO可抑制对细胞损伤后necroptosis。结论EPO对Aβ25—35诱导的细胞损伤后的neeroptosis具有保护作用，可能通过抑制caspase-3的裂解片段表达来实现。

BH3-only蛋白在非小细胞肺癌靶向治疗中的作用及意义

肺癌死亡率居全球恶性肿瘤死亡之首,非小细胞肺癌是肺癌中最常见的类型。在传统的抗肺癌治疗中,促进细胞凋亡是非小细胞肺癌治疗的一个重要组成部分,但抗肿瘤药物存在毒副作用大和耐药性等问题。因此,寻找新的抗肿瘤药物作用靶点成为非小细胞肺癌治疗的重点之一。BH3-only蛋白在凋亡的启动及凋亡通路的沟通中发挥极其重要的作用。BIM是BH3-only蛋白家族中的核心成员。以BIM为靶点的治疗在非小细胞肺癌的治疗中具有不可取代的作用。本文简单介绍了BCL-2家族和其中的BH3-only促凋亡蛋白,并且阐述了BIM、BH3-only蛋白在非小细胞肺癌靶向治疗中的重要作用。

扇贝多肽抑制紫外线A波诱导的HaCaT细胞凋亡依赖p38 MAPK通路和caspase-3

目的从p38促细胞分裂剂激活性蛋白激酶(p38MAPK)通路和半胱天冬酶-3(caspase-3)的角度,研究扇贝多肽(poly-peptidefromChlamysfarreri,PCF)抑制紫外线A波(UVA)引起的HaCaT细胞凋亡的分子机制。方法实验分为6组:对照组、UVA模型组、UVA+5.68mmol.L-1维生素C阳性对照组、UVA+5.69mmol.L-1PCF组、UVA+2.84mmol.L-1PCF组、UVA+1.42mmol.L-1PCF组。以正交实验设计确立UVA诱导HaCaT细胞凋亡模型;琼脂糖凝胶电泳分析PCF、p38MAPK抑制剂(SB203580)及caspase-3特异性抑制剂(Ac-DEVD-CHO)对细胞凋亡的影响;蛋白质印迹法检测p38MAPK及磷酸化p38MAPK表达;流式细胞术检测caspase-3的活性。结果PCF能明显抑制UVA引起的HaCaT细胞凋亡;SB203580和Ac-DEVD-CHO对UVA诱导的HaCaT细胞凋亡有抑制作用;1.425.69mmol.L-1内的PCF可剂量依赖性抑制UVA引起的p38MAPK磷酸化及caspase-3的活化。结论PCF可抑制UVA诱导的HaCaT细胞凋亡,其作用机制与抑制p38MAPK通路和caspase-3活性有关。

凋亡调节蛋白BIM的研究进展

Bim(Bcl 2interactingmediatorofcelldeath)是Bcl 2家族中BH3 only亚家族的成员 ,是一种重要的凋亡调节蛋白 ,在造血细胞的内环境稳定、防止自身免疫及肿瘤的发生中有着极其重要的作用。Bim广泛表达于正常细胞 ,存在多种异构体 ,一定的凋亡刺激能通过各种信号途径激活Bim分子 ,活化的Bim分子通过与Bcl 2 /Bax的相互作用激活Bax ,引起线粒体途径的细胞凋亡。而Bim分子本身受到严格的转录水平和翻译后水平的调节。

仅含BH3区域蛋白(BOPs)与Bax的研究

仅含BH3区域蛋白(BH3-onlyproteins,BOPs)及Bax均属于Bcl-2蛋白家族,其功能为调整细胞凋亡,不同的仅含BH3区域蛋白受不同的机制调节。二者功能的改变与多种疾病的发生有关,现就仅含BH3区域蛋白的作用机制、功能调节及二者在疾病防治中的作用简要综述。

仅含BH3区域蛋白与妇女疾病关系研究进展

BH3-onlyproteins(仅含BH3区域蛋白)属于Bcl- 2蛋白家族,功能为促进细胞凋亡,不同的仅含BH3区域蛋白受不同的机制调节。其功能的改变与多种疾病的发生有关,该文就仅含BH3区域蛋白的作用机制、功能调节及在妇女疾病中的作用进行综述。

唯BH3域蛋白在肿瘤治疗中的研究进展

唯BH3域蛋白作为Bcl-2蛋白家族的一大亚类,通过抑制Bcl-2抗凋亡蛋白和(或)激活Bcl-2促凋亡蛋白,在调节细胞凋亡的过程中起着极其重要的作用。许多癌症中编码唯BH3域蛋白的基因发生严重突变,而且在小鼠中敲除这些基因后可诱导肿瘤的发生,这提示唯BH3域蛋白可作为肿瘤抑制剂。唯BH3域模拟物正发展为新型小分子靶向抗癌药物,这可能有助于为肿瘤设计更好的治疗策略。

BH3拟似药物的发现及与组蛋白去乙酰化酶抑制剂的协同抗肿瘤作用

目的BH3-only蛋白是Bcl-2家族的促凋亡成员,可与抗凋亡成员结合启动肿瘤细胞凋亡和自噬。BH3拟似药通过模拟BH3-only蛋白促进肿瘤细胞凋亡和自噬,是肿瘤治疗中最具前景的药物之一。因此我们的研究目的是寻找新的BH3拟似药并阐明其抗肿瘤作用机制,为发展新的BH3拟似药奠定基础。方法通过基于药效团模型的虚拟筛选技术和分子对接筛选出潜在的BH3拟似化合物。用MTS实验检测筛选出来的化合物对多种肿瘤细胞的抑制率。采用AnnexinV/PI双染流式细胞术检测化合物对细胞凋亡的影响,免疫共沉淀(Co-IP)检测化合物对Bcl-2/Beclin-1复合物的影响。共聚焦显微镜检测化合物对肿瘤细胞自噬的影响,采用Western印迹法检测凋亡和自噬相关蛋白的表达。通过hoechst 33342染色、透射电镜、MDC染色检测AD23联合伏立诺他对肿瘤细胞蛋白与自噬的影响,动物实验检测AD23联合伏立诺他的抗肿瘤效果。结果筛选出BH3拟似化合物AD23。分子对接和表面等离子共振实验结果表明,AD23可与Bcl-2,MCL^(-1)和Bcl-XL蛋白结合,通过MTS实验发现AD23抑制小细胞肺癌细胞系作用最强。AnnexinV/PI双染实验结果显示,AD23可以浓度依赖性的促进H82细胞凋亡。Western印迹实验结果显示,AD23可以剂量依赖性诱导胱天蛋白酶3活化,诱导C-PARP蛋白增多从而激活凋亡通路。mCherry-GFP-LC3质粒转染结果显示,AD23可以浓度依赖性的促进自噬流过程的发生。Co-IP实验结果表明,AD23可时间依赖性促进Bcl-2与Beclin-1解离,AD23可以浓度依赖性的上调LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比例增加,下调P62蛋白的表达,从而激活自噬通路。细胞及动物实验结果表明AD23联合伏立诺他给药组促进H82细胞凋亡与自噬较单独给药组明显增加。结论BH3天然拟似化合物AD23可促进小细胞肺癌细胞凋亡与自噬,AD23与伏立诺他具有协同抗肿瘤作用。

右美托咪定对机械通气相关性肺损伤大鼠肺组织细胞凋亡的影响

目的 探讨右美托咪定（DEX）对机械通气相关性肺损伤大鼠肺组织细胞凋亡的影响。方法 清洁级雄性SD大鼠100只，采用随机数字表法将大鼠分为五组（每组n=20）：对照组（C组）、机械通气组（V组）和不同剂量右美托咪定组（DEX 1～3组）。机械通气参数设置：潮气量 40 mL/kg，呼吸频率 50次/min，吸呼比 1∶1,FiO2 21％。DEX 1～3组机械通气前20 min分别静脉输注DEX 0.5、2.5、5.0 μg/kg，机械通气期间DEX分别以0.5、2.5、5.0 μg/（kg·h）的速率静脉输注4 h。于插管即刻及机械通气1、2和4 h时采集股动脉血样，进行动脉血气分析，并记录PaO2，计算氧合指数（OI）。机械通气4 h时处死大鼠，回收肺泡支气管灌洗液（BALF），测定肺通透指数（LPI），取左肺下叶,测定肺湿/干质量（W/D）比值。采用Western blot法检测JNK、p-JNK、Bax、Bcl-2、 Caspase-3和唯BH3结构域促凋亡因子（BID、BIM）的表达水平。采用RT-PCR法检测JNK mRNA的表达。光镜下，观察肺组织病理学结果，测定肺泡损伤率（IAR），采用TUNEL法观察肺组织细胞凋亡情况并计算凋亡指数。结果 与C组比较，V组和DEX 1组OI降低，W/D比值、LPI、IAR（%）、AI（%）升高，p-JNK和JNK mRNA表达上调，促凋亡因子BID、BIM的表达增加，同时伴有Bax 表达增加，Bcl-2表达减少，Caspase-3表达增加（P＜0.05），DEX 2、3组上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）；与V组比较，DEX 2、3组OI升高，W/D比值、LPI、IAR（%）、AI（%）降低，p-JNK和JNK mRNA表达下调，促凋亡因子BID、BIM表达减少，同时伴有Bax表达减少，Bcl-2表达增加，Caspase-3表达减少（P＜0.05），DEX 1组上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）。与V组比较,DEX 2、3组肺组织病理损伤减轻，TUNEL法检测细胞凋亡减少。结论 DEX可减轻大鼠机械通气相关性肺损伤，与其抑制肺组织JNK磷酸化，下调唯BH3结构域促凋亡因子BID、BIM的表达，进而上调 Bcl-2表达，下调Bax表达，抑制 Caspase-3表达来减少肺组织细胞凋亡，减轻肺损伤有关。

PUMA介导大鼠缺氧/复氧心肌细胞凋亡的研究

目的研究促凋亡蛋白p53上调凋亡调制物(PUMA)在大鼠缺氧/复氧(H/R)心肌细胞凋亡中的作用及意义。方法原代培养的大鼠心肌细胞缺氧5 h后复氧2～12 h以制备缺氧/复氧损伤模型,靶向PUMA的siRNA转染大鼠心肌细胞以建立PUMA沉默表达模型。采用Annexin V-FITC联合PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率;分光光度法检测Caspase-3活性变化;RT-PCR、Western blot等方法分析PUMA及凋亡相关基因Bax、Bcl-2的mRNA及蛋白表达变化。结果与正常对照组相比,H/R处理后心肌细胞凋亡率及Caspase-3活性迅速上升;PUMA mRNA及蛋白表达上调,凋亡相关蛋白Bax表达上调及Bcl-2的表达下调。靶向PUMA的siRNA转染后,Bax上调表达及Bcl-2下调表达的程度明显被抑制。结论在大鼠心肌细胞缺氧/复氧过程中,PU-MA表达明显升高,其可能通过下调Bcl-2表达及上调Bax表达导致Caspase-3活性增加以介导心肌细胞凋亡。